亲和纯化技术.pptVIP

* 外源凝集素亲和电泳 利用外源凝集素对目标蛋白质的特异性作用进行亲和电泳。 适用于分析血清糖蛋白。 * 毛细管亲和电泳 将亲和技术应用于毛细管电泳——毛细管亲和电泳。 原理：根据底物、配基、与底物-配基复合物的迁移时间不同，采用毛细管区带电泳测定Kd或Kb。 用于手性药物及DNA片段的特异性分离。 第三节 亲和纯化技术的应用 一、亲和萃取法制备抑肽酶 二、Protein A亲和层析凝胶纯化抗体 三、金属离子亲和层析纯化重组蛋白 四、谷胱甘肽琼脂糖亲和纯化重组融合蛋白 五、生物分子相互作用研究 * Protein A亲和层析凝胶纯化抗体 * * 谷胱甘肽琼脂糖亲和纯化重组融合蛋白 Glutathione-Sepharose 4B:纯化羧端含谷胱甘肽 S-转移酶重组融合蛋白 (GST-protein) * Protein –protein interaction----glutathione * 配基的选择和洗脱条件 * （三）、亲和吸附剂的再生 用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。 * 七、 亲和层析的吸附和洗脱 影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生 * 八、其他亲和层析 金属离子亲和层析 有机染料亲和层析 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC） * （一）、金属螯合亲和层析 将环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。 金属螯合剂:亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 . * 金属离子亲和层析 蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。 金属离子如锌和铜。 * 金属离子亲和层析 吸附：pH在6~8。 洗脱：降低pH值、增加离子强度、或在缓冲液中加5mmol/L EDTA等方法。 特点： 蛋白质吸附容量大； 价格便宜； 具有普遍适用性。 * His-protein purification * （二）、有机染料亲和层析 需NAD+为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。 染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。 染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。 * （三）、拟生物亲和层析（Biomimetic AFC） 模拟生物分子结构或某特定部位，以人工合成的配基制备亲和吸附剂，吸附目的蛋白质. 以氨基酸（包括多肽）亲和层析和染料亲和层析为代表。 多肽是纯化生物大分子有效的配基。 * 第二节 其他亲和纯化技术 一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳） * 一、 亲和过滤（Affinity Filtration） 将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。 亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。 * 亲和错流过滤 （affinity Cross Flow Filtration） 基质及大分子亲和配基 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体； 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。 * 基质 聚丙烯酰胺 菌类的完整细胞 （酵母、芽胞杆菌、链球菌等细胞） 琼脂糖、脂质体等 酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A * 第一节 亲和层析 一、亲和层析的原理 二、亲和层析载体 三、 亲和配基 四、载体的活化与偶联 五、影响吸附亲和力的几个因素 六、配基与间隔臂的连接 七、亲和层析的吸附和洗脱 八、其他亲和层析 * 第二节 其他亲和纯化技术 一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳） * 亲和膜 （affinity membrane） 亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。 * 亲和膜优点 传质阻力小，达到吸附平衡的时间短； 配基利用率高，配基用量低； 压降小，流速快； 设备体积小。 * 二、亲和萃取  （Affinity extraction） 定义：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作