遗传果糖不耐受症的检测方法建立.pdf

第 3 5 卷 第 1 期 佛山科学技术学院学报（自然科学版 ） Vol. 35 No. 1 2 01 7 年 1 月 Journal of Foshan U niversity (N atu ral Sciences E dition) Jan. 2017 文章编号：1008-0171(2017)01-0064-03 遗传果糖不耐受症的检测方法建立 黄源坚 (广东华美众源生物科技有限公司，广东佛山 528000) 摘要：目的对罕见的人遗传性果糖不耐受症进行常规方法建立，为日后临床检验提供方法依据。方法运用基因 合成的办法合成带有突变的基因片段，用诊断性PCR 产物直接测序分析其基因组上的A 149P A，174D 和 N334K 的 3个主要的基因突变位点。结果通过NCBI上的基因序列，合成出相应的突变基因片段为阳性对照，后连接到 18T 载体，挑菌并通过测序结果显示，确定其A 149P 、A 174D 序列正确。结论运用 PCR 结合DNA测序的分析方 法，可在分子遗传水平上，从基因上直接判断是否存在患病的可能，如结合临床诊断，那将会大大提高该罕见病 的流行调查效率。 关键词:遗传性果糖不耐受症;基因突变位点检测;PCR 扩增鉴定 中图分类号：R394 文献标志码:A 遗传性果糖不耐受 （hereditary fructose intolerance,HFI) 是因果糖二憐酸醛缩酶(fruetaidolase, fmctose-1,6-diphosphatealdolase)缺陷所致的先天性代谢紊乱性疾病，也是一种常染色体隐性遗传性疾 病。因缺乏1-磷酸果糖醛缩酶[1]，1-磷酸果糖不能进一步代谢，在体内积聚，抑制肝磷酸化酶活性，影响 糖原降解，并在1，6-二磷酸果糖水平阻止糖异生的进行。本病主要表现在进食含果糖食物后出现低血 糖和呕吐。 如果能够早期识别，禁食糖类饮食，可以明显减轻患儿的临床症状，改善预后。到目前为止，文献共 报道59多种不同的ALDOB 基因突变类型[2]，其中最为常见的是A 149P 、A 174D 和 N 334K ，对喜欢糖食 的人群进行以上几种基因突变的检测可以作为HFI 的基因筛查。 本研究拟合成NCBI上的遗传性果糖不耐受症特征片断扩增，后直接送去测序鉴定，从基因水平上 证实了该突变基因的存在，并且就此建立一组对照基因，结合 PCR 扩增鉴定的方法，为日后结合临床诊 断具有一定的参考意乂。 1 材 料 与 方 法 1.1研究对象 在美国NCBI上，查询到遗传性果糖不耐受症的对应序列（NC -000009.12)。 1.2目标基因的合成 根据文献资料[3]，确定 A 149P 及 A 174D 的突变位点，合成其基因序列如下 :CAAAGGGAGAACTCC TTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGC AGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGT 收稿日期：2016-11-24 作者简介:黄源坚(1987-),男，广东佛山人，广东华美众源生物科技有限公司助理工程师。 第 1期 黄源坚:遗传果糖不耐受症的检测方法建立 65 GCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTC GCTACGCCAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTC TTCAGAGCTnTCTnTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTnrCCC ,及 N 334K 也是按相同办 法进行合成，并将该序列交于广州艾基生物有限公司进行合成,后通过本实验室进行18T 载体的连接， 并转化到大肠杆菌中，进行挑菌验证。 1.3 PCR 扩增用引物