醋酸薄膜电泳.pptVIP

实验目的 1、掌握电泳法分离蛋白质的原理 2、熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的操作、注意事项 3、熟悉测定血清中各种蛋白质相对百分含量 的方法 4、了解A\G的临床意义 电泳 依据分子或颗粒所带电荷、形状、大小等不同，因而在电场介质中移动速度不同，从而达到分离的技术。 二、电泳的影响因素 分离样品的性质 电泳介质的pH 缓冲液的离子强度 电场强度 电渗作用 电渗作用 在电场中液体对固体支持物的相对移动. 三、电泳的分类 醋酸纤维素较纸电泳的优点 电渗作用影响小 醋酸纤维素膜对蛋白的吸附小，几乎无“拖尾”。 由于醋酸纤维素亲水性小，所容纳的缓冲液也较少，电流大部分是由样品传导，所以分离速度快。 血清蛋白质 清蛋白和球蛋白 血清蛋白电泳的正常组分 醋酸纤维膜电泳蛋白组分变化的临床意义（A/G） 实验结果 注意事项 1.点样面为不光滑面，勿用手触摸感知； 2.点样量适中，垂直点样； 3.点样端接电泳仪负极； 4.膜条与滤纸需贴紧，拉直； 5.谨防触电。 1、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 2、电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成分？请分析原因。 3、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？ 待分离大分子的性质 所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 缓冲液的离子强度 离子强度过低，则缓冲能力差，不易维 持PH恒定； 离子强度过高，在待分离分子周围形成 较强的带相反电荷的离子扩散层（即离 子氛），降低了蛋白质的带电量，使电 泳速度减慢。 一般所用离子强度为0.02-0.2之间。 电场强度 过高，产热，样品和缓冲液扩散增加，条带增宽。蛋白变性（当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置） 过低，电泳时间增加，缓冲液扩散减慢。 pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大。pH过高或过低会引起蛋白质变性。 电泳介质的pH 电场强度：电泳支持物上每厘米的电位差，也称电势梯度。 * * 实验三 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 （Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins） 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 一、电泳 H＋ OH－ H＋ OH－ pHpI pH=pI pHpI 阴离子，向正极移动 阳离子，向负极移动 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。 负极 正极 － － － － － － － － 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 支持介质不同 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） 支持介质装置形式不同： ⑴ 平板式电泳 ；?? ⑵ 垂直板式电泳 ；?? ⑶垂直柱式电泳 pH 的连续性不同： 连续pH 电泳 非连续pH 电泳 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins 本实验以醋酸纤维膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。 醋酸纤维膜是由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中。 实验原理 醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯 清蛋白和α1、α2、β、γ-球蛋白 电泳 血清蛋白的等电点pI大多在7.5以