重组dna技术-2003-i.ppt

重组DNA技术及应用Recombinant DNA Technology and its Application 许正平 博士 浙江大学医学院生物电磁学省重点实验室 参 考 书 思 考 1、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得 （克隆）该基因？ 2、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得 （克隆）该基因？ 3、基于氨基酸或全蛋白序列的基因克隆 4、如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其 结构、功能？ Basic Procedure 解决方案(Solution) DNA片段间的连接Ligation of DNA Fragments DNA向细胞的转移Transferring DNA into Cells 二、载体和工具酶Vector and Enzyme （一）载 体 载体的特点The Characteristics of Vector 能在宿主细胞中独立复制 有一定的选择标记（selection marker），易于识别和筛选 可容纳外源DNA，而又不影响其本身的复制 有合适的限制酶切位点，以便于克隆 载 体 类 型The Types of Vector 质粒载体 噬菌体载体 ?噬菌体 丝状噬菌体 粘粒载体 噬粒载体 卡粒载体 酵母克隆载体 植物克隆载体 动物克隆载体 质粒：基本特性Plasmid: basic properties 复制能力和不相容性 复制能力相差悬殊：松弛型/严紧型 不相容性：利用同一复制系统的质粒不能在同一宿主 中稳定共存 转移性 常用质粒无mob基因，不能进行接合转移 选择标记 抗生素抗性基因：Amp, Tet, Cm, Kan或Neo 常用克隆技术 Common Cloning Technologies TA Cloning Invitrogen Taq-amplified PCR products TOPO? Cloning Invitrogen TOPO TA Cloning: pCR? -TOPO? Zero Blunt? Cloning: pCR ? -Blunt or pCR? -Blunt II-TOPO? GATEWAYTM Cloning Invitrogen The GATEWAY? Cloning Technology provides a rapid and highly efficient route to protein expression, functional analysis and cloning/subcloning of DNA segments across multiple systems and in multiple vectors. Principle: lambda site-specific recombination GATEWAYTM Cloning GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.Methods Enzymol. 2000;328:575-92  酵母克隆载体Cloning Vector for Yeast 酵母双杂交系统(Yeast Two-Hybid System) 工 作 原 理 系 统 组 成 筛选结果的判定 动物细胞克隆载体Cloning Vector for Mammalian Cell （二）工 具 酶 限制性内切酶 限制性内切酶(Restriction Endonuclease) 同裂酶(Isoschizomer) 甲基化作用和甲基化酶 双酶切(Double Digestion) 酶切体系 连接反应体系Ligation Reaction DNA的分析 (DNA Analysis) 三、DNA文库的构建Construction of DNA Library （二）基因组文库的构建Construction of Genomic Library (三) cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library Question 解 决 方 案 SMART cDNA Library Construction Kit 高比例的全长cDNA 无接头连接,定向克隆: 三种阅读框同时表达,适于表达筛选 一步质粒化(loxP),方便亚克隆 起始RNA用量少(最少用量50ng总RNA/25ng mRNA) (四) 文库的筛选Library Screening