重组dna技术-2014-02-25.pptVIP

* * * * * * （三）感染（infection） 感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组体DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞。 感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂的体外包装过程。 (一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1．根据载体的抗药性标记筛选 2．根据载体的抗药性标记插入失活选择 3．根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选 4．根据插入的外源基因性状进行筛选 (二）限制性核酸内切酶酶切鉴定 （三）核酸分子杂交法 （四）PCR法 （五）免疫化学检测法 （六） DNA序列检测： 二.重组体的筛选与鉴定 1.抗药性标记选择 Ampr Tetr BamHⅠ位点 BamHⅠ酶切 BamHⅠ酶切 DNA连接酶 目的DNA 重组质粒 大肠杆菌 含Amp平板 含Amp平板 含Tet平板 2.抗药性标记插入失活选择 3．根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选 :标志补救 lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal 4．根据插入的外源基因性状进行筛选 如把酵母基因组DNA随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸缺陷型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸的培养基中培养。这样只有含酵母组氨酸基因并获得表达的转化菌才能在无组氨酸的培养基中生长。 （二）.限制性核酸内切酶酶切鉴定 凝胶电泳检测 加样孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段 原位杂交 （三）.核酸分子杂交法:菌落杂交筛选法 （四）.PCR法 某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增。 如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 （五）.免疫化学检测法 （六）.DNA序列检测 ACTGAAGGCT 标准：选择标志，强启动子 ，翻译调控序列，多接头克隆位点 外源基因在原核细胞中的表达： 1．融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表达。 2．非融合型表达蛋白 3．分泌型表达蛋白 利用分泌型表达载体，需要在信号肽的帮助下进行。4．包涵体 1. 原核表达体系 第七节 克隆基因的表达 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞） 真核表达载体大多是穿梭载体, 通常包括以下元件： 1．启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。 2．增强子 3．剪接信号 4．终止信号和PolyA化信号 5．遗传选择标记 ：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。 新霉素抗性选择系统 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真核细胞。 重组DNA技术与医学 的关系非常密切并前景远大 DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（