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第四章 园艺产品采后生物技术 第四章 园艺产品采后生物技术 §1 生物技术的基本概念 生物技术(biotechnology)，也称生物工程(bioengineering)，指利用生物有机体(从微生物到高等动植物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺的一种技术体系。 §2 园艺产品采后生物技术 一、基因工程 ?目的基因(objective gene) 又叫靶基因(target gene)，是指根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子的片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码(code)。 分离、合成目的基因的方法 ?分离、合成目的基因的方法 ?2) 构建CDNA文库(CDNA library)：这种方法主要应用于分离植物组织中丰富表达的基因。对于表达量较少的基因，可通过限制性内切酶切割、电泳分离富集之后使用。然后，通过提取植物中的mRNA，经过逆转录酶的作用合成CDNA(complimentary DNA)，再选择合适的载体构建CDNA文库。 3) 合成法：如果已知目的基因的碱基排列顺序，就可以采用不同的核苷酸为原料，用特定的酶催化，直接合成目的基因。 植物转基因技术(gene transplant technology) 定义：就是利用生物、物理或化学等手段，将外源基因导入植物细胞，以获得转基因植株的技术。 目前的植物转基因技术可分为两大类，即以载体(vector)为媒介的基因转移vector mediated gene transfer和DNA直接转移 naked DNA transfer。 ⅲ Ri质粒(Root inducing plasmid) ⅰ 基因枪 (gene gun) ⅱ 原生质体直接转移法 ⅲ 激光微束穿孔法 ⅳ 电泳转移法 ⅴ 超声波穿透法 ⅵ 花粉管通道法 ⅶ 花粉吸收(外源DNA)转化(授粉)法 ⅷ 微注射(显微操作注射)法 ⅸ 种子或胚的DNA浸泡法 ⅹ 脂质体融合法 ③ 转基因方法 根癌农杆菌介导的基因转移技术 根癌农杆菌是使受感染植物形成冠瘿瘤(crown gall)的病原因子。冠瘿瘤的形成是由于根癌农杆菌含有一种大的Ti质粒(plasmid)，它使一组控制植物激素(生长素、细胞分裂素)基因从根癌农杆菌转移并整合到植物细胞基因组的结果。??? 根癌农杆菌介导的基因转移技术是目前应用最广泛、最成功的转基因技术。 基因枪转基因技术 基因枪(gene gun)又叫粒子轰击，是一种将载有外源DNA(目的基因)的钨(tungsten)或金等金属颗粒(直径0.5-5μm)加速到每秒数百米的速度，穿过细胞壁射入细胞质(cytoplasm)中的物理学方法。采用的加速动力是火药或高压放电，或高压气体(氮气、氢气、氧气)加在粒子上的瞬时动量。 d 操作简单、迅速，但费用较高 原生质体直接转基因技术 其过程是：细胞去壁，分离得到原生质体，然后将一定浓度的原生质体与DNA(目的基因)混合，在加PEG溶液或电场剌激的条件下，使DNA进入原生质体，通过原生质体的选择培养，再生植株。 该方法简单易行，但也由于一些植物的原生质体再生植株困难，限制了这项技术的应用。此外，原生质体的再生植株容易发生变异，也是限制因素之一。 筛选 植物外植体(explant)经过农杆菌或DNA直接转化后，大部分的细胞是没有转化的，只有极少数被转化，这就需要采用特定的方法将未转化细胞与转化细胞区分开来。 目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞的淘汰常用抗生素抗性基因和除草剂基因(总称筛选标记)。如： cat基因、ACC(3)、 dhfr 、Spt、bar 、NptII(neomycinphosphotransferase)等。 筛选 为了快速简易地区分转基因植物和非转基因植物，植物的遗传转化研究中还常用到另一类基因，称为报告基因(reporter gene)。目前常用的报告基因有： NOS(nopalinesynthase)，OCS(octopine synthase)，CAT(chloramhenicol acetyl transferase)，NPTII(neomycinephosphotransferase)，LUC(firefly luciferase)和GUS（β-glucuronidase）基因等，其中GUS基因和NPTII基因能耐受氨基末端融合，而且检测简单，是目前应用最多的报告基因。 Southern Blot 与杂交技术 DNA的互补单链与RNA能和探针(probe，即一小段DNA或RNA)，产生同源双链DNA-DNA或异源双链DNA-RNA，当两条互补链之一固定在一块硝酸纤维膜(nitro