第五章分子生物学研究法2特别重要章节.ppt

分子生物学研究法 ;引 言;基因工程的理论依据： 遗传物质——DNA DNA双螺旋结构模型 操纵子学说 基因的表达与突变（中心法则） 基因工程的工具酶的发现;基因工程的主要内容或步骤;*;*;*;重组DNA技术发展史上的重大事件;*;*;*;*;*;限制性核酸内切酶(restriction enzyme);命名;从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为：;? 特性：①识别序列有对称性（回文结构） 5’-GGTACC-3’ 3’-CCATGG-5’ ②识别序列一般为4—8个核苷酸； ③如果碱基被修饰，则不能被识别； ④切口：粘性末端和平口末端 ;*;*;*;*;*;限制性核酸内切酶的分类;DNA连接酶; DNA连接酶 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基和在另一条DNA链5’-末端具有一个磷酸基团，而且还需要有一种能量分子的存在才能实现这种连接反应。;*;*;DNA重组技术中最常用的工具酶;*;*;载体 vector;载体的基本要求： 1. 复制单位;能在受体细胞中独立复制。  2. 克隆位点(多个单克隆位点); 3. 有可供选择的遗传标志（筛选标记）。  4. 分子量尽可能小;易于分离、纯化、导入受 体细胞。 5. 外源DNA插入后不影响载体本身的复制. 没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.;质粒(plasmid)—是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的小型环状双链DNA分子。 ——理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS);*;质粒的命名原则 ? 用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大 写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名 称。后面的数字是构建质粒的编号。如： pUC18和pBR322。;最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，;*;转化（transformation）：重组质粒DNA转入受体细胞的过程。 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 ;几类常见的质粒;测序质粒：加装测定顺序所必需的序列。;*;表达载体(expressing vector);穿梭质粒：具有两种不同的复制起点和选择记号，因而既能在原核细胞，又能在真核细胞中生存和扩增的质粒。例如大肠杆菌－酿酒酵母穿梭质粒载体，既能在大肠杆菌中进行繁殖，又能返回到酿酒酵母中进行操作。;质粒DNA分离纯化;碱变性法抽提质粒DNA 原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。根据染色体DNA与质粒DNA分子的大小、构型及变性与复性的差异而达到分离的目的。染色体DNA的分子大， 细菌基因组均比较大，为双螺旋，如大肠杆菌的染色体约有4700 kb长，质粒DNA分子小，为超螺旋。当溶液的pH值调节到大于12时，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA双链完全分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅部分氢键被破坏，只是部分双链解离成单链。再将溶液的pH值调回中性时，单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍然是小分子，通过离心很容易将两者分开。达到分离的目的。 ;操作步骤 1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ(0.2N NaOH，1% SDS。)，颠倒数次混匀（不