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矮化大豆内源激素表达水平的研究 姓名：崔志强 导师：徐永清 摘 要 本文研究是以东农42及其矮化突变体HK808为实验材料，利用高效液相色谱技术进行的研究。对两个品种的内源激素表达水平差异进行了系统深入的研究。系统地阐述了大豆矮化突变体在内源激素方面与其野生型东农42的差别。 前 言 阐述了矮化作物的研究价值，对我国矮化方面的研究及相关成果作了简要概述。提出了本篇论文研究的内容。最后说明了此次研究的目的。 1.材料与方法 试验材料：以东农42及其矮化突变体HK808的6叶1心期至13叶1心期的茎尖及茎为植 物材料。 试验方法：1.分离与纯化 东农42及HK808的茎尖及茎，选取8-15株，剪碎混合，鲜样分装成1.0g样品； 液氮速冻，研磨成粉末状； ↓ 向研钵中共加80%预冷的甲醇10ml，移入离心管中，再加入0.2g PVPP； ↓ 不断振荡，于4℃冰箱中避光过夜； ↓ 12h后振荡、4℃离心(15000r/min,10min)，上清液保存，残渣用80%甲醇10ml溶解，同时加入PVPP0.2g，充分振荡、4℃离心(15000r/min,10min)，重复2次； ↓ 合并上清液，再加入PVPP，振荡离心(15000r/min,10min)，上清液置于三角瓶中真空干燥浓缩至原体积的1/3； ↓ 过0.45um有机系超微滤膜； ↓ 通过Sep-Pak C18柱收集滤液于三角瓶中，真空干燥去除甲醇； ↓ 用3ml的PH3.0柠檬酸缓冲液进行溶解，然后乙酸乙酯等体积萃取2次，合并乙酸乙 酯相，真空干燥去除乙酸乙酯，1ml流动相溶解，过0.45um滤膜； ↓ 保存于4℃冰箱中待测。 2.标准曲线绘制 采用高效液相色谱法对控制植物株高密切相关的内源激素GA3、IAA及ABA进行测定。 测定具体色谱条件：流动相为100%甲醇-水-冰乙酸(体积比为45：54.2：0.8)混合液，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，进样量为20ul，检测波长为254nm，定量方法为外标标准曲线法。 激素标准液的配置：准确称取IAA、GA3和ABA各5.0mg，用流动相溶解，并定容至5ml，使母液浓度为1.0mg/ml，置于-20℃冰箱中避光保存。进样之前用流动相稀释，使IAA浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4ug/ml；GA3浓度分别为500、1000、2000、3000、4000ug/ml；ABA浓度分别为0.01、0.025、0.1、0.2、0.4ug/ml，最后将三种激素混标体积定容为1ml。 三种标准品的HPLC色谱曲线上，赤霉素标准品的保留时间2.100min，吲哚乙酸标准品的保留时间为4.738min，脱落酸的保留时间为5.382min，以此为对照，根据不同标准品的浓度，得出色谱峰面积，绘制标准曲线。 通过试验结果绘制得到标准曲线，得峰面积y与标准品浓度x(ug/mL)之间的回归方程 。 2.结果与分析 通过结果分析得出：东农42中GA3的含量显著高于HK808，IAA的含量要显著低于HK808，茎尖中东农42 的ABA含量显著低于HK808，但在茎中两者无显著差异，茎尖及茎中的几种激素的比例分析表明，赤霉素在几种激素的比例中起到主导作用。 3.讨论 本部分就突变体HK808的IAA含量较高，但出现矮化性状的结果进行了推理。原因可能是：激素间相互影响造成。GA可调节IAA水平。这是因为GA可以降低了IAA氧化酶的活性并促进蛋白酶活性，使蛋白质水解，IAA的合成前体(Trp)增多，GA促进IAA束缚型转化成游离型；另一个原因可能是HK808中的高浓度ABA对IAA产生拮抗作用，使IAA不能发挥其生理作用 。 4.结论 两个试验品种茎尖及茎的内源激素含量变化及比值变化表明：在茎尖中，东农42中赤霉素的含量显著高于HK808，东农42 GA3含量比HK808最多高出5.8倍（11叶1心）。在茎尖部东农42中IAA的含量显著低于HK808，IAA含量两个品种最多的时候相差43倍（10叶1心）。茎尖中，东农42 的ABA含量显著低于HK808，两者差距在前三个时期较小在4-7倍左右，后五个时期差距逐渐扩大，最高的差距在11叶1心时达到了34.8倍。东农42的GA3/ABA与(GA3+IAA)/ABA比值大HK808，而IAA/ABA的比值HK808均大于东农42并且呈显著差异。 茎部的内源激素含量测定表明，茎部东农42的GA3含量显著大于HK808，两个品种中GA3含量最多相差3.8倍（10叶1心）。而HK808中的IAA含量显