实验三 DNA重组技术.pptVIP

实验二 DNA重组技术 实验目的 实验原理 实验原理 　 　 重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛 　　 实验仪器 材料及试剂 材料及试剂 试剂 实验步骤 实验步骤 转化及筛选 实验结果 实验报告 恒温空气摇床 恒温培养箱 培养皿 恒温水浴锅 E.coli DH5α pUC19质粒 λDNA EcoRI酶 3mol/L Kac (pH5.2) Xgal (20mg/ml) IPTG (200mg/ml) 1. T4DNA连接酶 2． 10×T4DNA连接酶缓冲液: 400mmol/L Tris-Cl pH7.5 100mmol/L MgCl2 100mmol/L DTT, 500 μg/ml BSA 5-10mmol/L ATP 3．? 限制性内切酶（PstI） 4．? 10×限制性内切酶缓冲液 500mmol/L Tris-Cl 100mmol/L MgCl2 1000mmol/L NaCl 1mg/L BSA 5. 灭菌去离子水 1．??? 混合以下溶液于一个无菌离心管中 xμl pUC19 质粒 (0.1-4μg) 2μl 10×酶切缓冲液 1－5U 限制性内切酶（EcoRI） yμl 去离子水 终体积为 20μl 2．??? 在推荐温度下育温1小时（一般为37℃） 加入5μl电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。 酶切 1．混合以下试剂 λ DNA 7.7μl pUC19 DNA 1 .0μl 10×T4DNA连接酶缓冲液 1.0μl T4DNA连接酶(10u/μl) 0.3μl 混合液于14℃培养12小时 连接 * * 通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。 基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。 重组DNA 质粒DNA 基因片段 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有5’磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键，但如果质粒DNA已经去磷酸化，则只能行成2个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。 相邻的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 限制性内切酶酶切 切 酶切 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 重组体的转化 受体细胞 转 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组质粒 感受态 原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型：避免重组整合 转化亲和型：较高的可转化性 遗传互补型：利于筛选 感染缺陷型：防止感染 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 含氨苄平板 连接 目的基因