人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定.doc

人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定 王广宇，王 雨，朱艳萍，康煜冬，王伏声，丁 毅，董 雨，徐旭英(首都医科大学附属北京中医医院疮疡外科，北京市 100010) 引用本文：王广宇，王雨，朱艳萍，康煜冬，王伏声，丁毅，董雨，徐旭英. 人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定[J].中国组织工程研究，2016，20(51):7678-7683. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.012 ORCID: 0000-0002-5389-9000(王广宇) 文章快速阅读： 文题释义： 内皮细胞：也称血管内皮细胞，通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮，它形成血管的内壁。它们具有吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与集体免疫活动功能。 微血管：一般指毛细血管。毛细血管(capillary)是管径最细(平均为6-9 μm)，分布最广的血管，它是连接微动脉和微静脉的血管。它们分支并互相吻合成网。管壁薄，通透性强，其功能是利于血液与组织之间进行物质交换。 摘要 背景：目前，国内外研究多采用酶消化法结合免疫磁珠法分离微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人皮肤微血管内皮细胞分离、培养，同时又能获得到高纯度的内皮细胞体外培养方法成为研究热点。 目的：探索一种简便高效的来源于糖尿病患者皮肤微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。 方法：利用临床上糖尿病伴足部慢性创面截肢后，肢体近心端皮肤和局部创面周围皮肤真皮浅层组织。经剪碎后采用贴壁法和短时少量应用胰酶法得到人皮肤微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。 结果与结论：①实验成功获取人皮肤微血管内皮细胞，原代培养的人皮肤微血管内皮细胞在培养24 h 后基本完全贴壁，第10 天进入对数生长期，第12 至13 天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7 d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布；②免疫组织化学染色结果显示，培养的细胞中FⅧ因子与CD31 相关抗原呈阳性，细胞阳性率达100%；③MTT 法测得培养第2、4、5代人皮肤微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。④结果证实，应用贴壁法，并在培养过程中少量短时应用胰酶法，可获得大量高纯度的人皮肤微血管内皮细胞。 关键词： 组织构建；血管内皮细胞；微血管；人皮肤真皮浅层；原代培养；免疫组织化学染色；细胞鉴定；FⅧ因子相关抗原；CD31；MTT法；国家自然科学基金 主题词： 皮肤；内皮细胞；血管；组织工程 基金资助： 国家自然科学基金资助项目面上项目；首都中医药研究专项一般项目(15zy16)；医院骨干课题(2014GG-01) Isolation, cultivation and identification of human skin microvascular endothelial cells Wang Guang-yu, Wang Yu, Zhu Yan-ping, Kang Yu-dong, Wang Fu-sheng, Ding Yi, Dong Yu, Xu Xu-ying (Department of Ulcer Surgery, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China) Abstract BACKGROUND: Currently, the enzymatic digestion combined with magnetic activated cell sorting for isolating microvascular endothelial cells are cumbersome and do harm to cells. Therefore, how to simplify the isolation and culture of human dermal microvascular endothelial cells to obtain highly purified endothelial cells in vitro becomes a hotspot. OBJECTIVE: To explore a simple and effective cultivation method of microvascular endothelial cells from diabetic patient skins in vitro, and to detect the cell growth.