植物基因工程载体及其构建要领.pptVIP

第八章?????植物基因工程载体及其构建 第一节???植物基因工程载体种类 第二节???根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 第三节???Ti质粒基因转化机理 第四节???Ti质粒的改造及载体构建 第五节???常用选择标记和报告基因 植物基因转化系统 l? 1.载体转化系统（Ti质粒转化载体、Ri质粒转化载体、病毒转化载体） l???2.?DNA直接导入转化系统（原生质体、基因枪） l? 3.种质转化系统（花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊子房注射法）。 载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多、机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统, 其中又以Ti质粒转化载体最为重要。 第一节 植物基因工程载体种类 根据其功能和构建过程，可分为以下种类。 （1）目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因。与微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的E. Coli小质粒为载体。 （2）中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒。是由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段、目的基因和标记基因等构建而成。 （3）中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体。是构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，是构建转化载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：是最后用于目的基因导人植物细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。 第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 二、T-DNA的基因结构与功能 三、Vir区操纵子的基因结构与功能 一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 1. Ti质粒的遗传特性及类型 l??????? Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D, 约有200kb组成。 l??????? 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型（agropine）和农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine) 2. Ti质粒的功能区域 Ti质粒可分为四个区。 （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。 （3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 3. Ti质粒的生物学功能 Ti质粒的功能可归为以下7个方面: ①? 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。 ② 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。 ③???赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。 ④???赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。 ⑤???为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。 ⑥???决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦? 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”。 二、T-DNA的基因结构与功能 ????????? 1.T-DNA的发现 Chilton等人（1982）利用同位素标记的Ti质粒做探针发现，加入高浓度烟草肿瘤细胞的DNA后，Ti质粒DNA的复性速度有加快的趋势。这表明肿瘤DNA中有Ti质粒的顺序，但该顺序不多，而且没有检测到完整的Ti质粒。以后这些作者将章鱼碱型的Ti质粒B6-806用内切酶Sma I分解成19个片段，分别用同位素标记做成探针，然后与肿瘤DNA进行分子杂交，结果有二段Ti质粒的DNA（3b和10c。）能和肿瘤DNA杂交，也就是Ti质粒中这两段DNA是与肿瘤DNA同源的部分。进一步研究证明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。这是首次证明在高等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序。 2.T-DN