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1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及其来源 菌种接种于营养肉汤培养基中，37℃，振荡过夜培养至菌悬液浓度达到 109CFU/ml.。 1.1.2 培养基 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、Baird-Parker培养基，购自北京市陆桥技术有限公司；Petrifilm RSA. Count Plate 购自美国3M 公司； Baird-parker+RPF Agar 购自法国梅里埃公司。 1.1.3 乳制品 全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。 1.1.4 仪器及试剂 10×PCR buffer 、dNTPs 、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000 ，购自大连宝生物工程公司；引物（正向引物, 反向引物）由大连宝生物工程公司合成；溶葡萄球菌酶购自上海高科技术有限公司；无水乙醇、石油醚、氯仿、氨水、糖原均为国 产分析纯产品。 PCR 仪为Whatman T Gradient基因扩增仪，电泳 仪为北京市六一厂生产 DXY-33A型电泳仪，凝胶成 像系统为华粤企业集团有限公司 UVIpro凝胶成像系 统。 1.2 方法 1.2.1 乳制品人工污染 在人工污染金黄色葡萄球 菌前，全脂乳、脱脂乳和奶酪均按国标法检测证实不 含有金黄色葡萄球菌。（1 ）将金黄色葡萄球菌人工污 染到全脂乳和脱脂乳中，使样品中金黄色葡萄球菌的 浓度依次为 10 0 、10 1 、10 2 、10 3 、10 4 、10 5 、10 6 、10 7 、 10 8 CFU/ml，直接提取人工污染脱脂乳和全脂乳中金 黄色葡萄球菌的 DNA。（2）奶酪人工污染金黄色葡 萄球菌的方法为：取20 g 奶酪在研钵中磨碎，加入 40 ℃ 2%柠檬酸钠 90 ml 混匀制成均质液，然后对奶酪 均质液人工污染的浓度依次为10 0 、10 1 、10 2 、10 3 、 10 4 、10 5 、10 6 、10 7 、10 8 CFU/ml，直接提取奶酪均质 液中金黄色葡萄球菌的DNA。 1.2.2 DNA提取 [10] 步骤如下：（1 ）将 1 ml无水 乙醇、1 ml 氨水和1 ml 石油醚分别加入到 5 ml 人工 污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪均质液 中，混匀。 （2）混合物以 12 000 ×g，离心 10 min 。弃去上 清液，沉淀用 300 μl 10 mmol·L -1 TE （pH 7.8 ）溶解后， 加入 5 μl 10 mg·ml -1 溶葡萄球菌酶，37 ℃温育 1 h，期 间不断剧烈振荡。然后加入 50 μl 10%的SDS ，煮沸 5 min。 （3 ）将等体积的氯仿加入上述混合液中，充分振 荡混匀，17 000 ×g 离心 10 min ，弃沉淀，保留上清 液。 （4 ）将上清液移入一新的离心管中，用 0.1 倍体 积2.5 mol·L -1 乙酸铵（pH 5.4 ），2.5倍体积预冷无水 乙醇和5 μl 10 mg·ml -1 糖原沉淀DNA，混合物 17 000 ×g，离心 20 min 。DNA沉淀干燥后用 100 μl 灭菌双 蒸水溶解，备用。 1.2.3 PCR 引物序列引自文献[1, 4] ，由大连宝生 物公司合成。正向引物：5′ -GCGATTGATGGTG ATACGGTT-3′ ，目的扩增产物大小为 279 bp ；反向引 物：5 ′ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ′ 。 PCR 反应体系：总反应体系50 μl。包括5 μl 10×PCR buffer，4 μl dNTPs 混合物，0.5 μl 40 μmol 正 向引物，0.5 μl 40 μmol 反向引物，0.25 μl （5 U·μl -1 ） Taq，模板 2 μl ，水 37.75 μl。PCR 扩增程序：PCR 反 应采用冷启动。94 ℃预变性4 min ，再按94℃1 min→52℃0.5 min→72℃1.5 min进行35 个循环，最后 72℃延伸 3.5 min。电泳检测：取 5 μl PCR 产物在2% 琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果 并成像。PCR 产物鉴定：大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行DNA测序。 1.2.4 PCR 方法与其它快速检测金黄色葡萄球菌方 法比较 （1）本研究利用 PCR 直接检测乳品中金黄 色葡萄球菌方法与两种快速检测致病性金黄色葡萄球 菌的培养基及GB 4789.10–94 方法进行比较，确定 PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法的特异性、 符合率、灵敏度。（2）所采用的两种快速检测致病性 金黄色葡萄球菌的培养基分别为：Petrifilm