细胞冻存和解冻复苏实验.docxVIP

细胞生物学实验  PAGE \* MERGEFORMAT 3 细胞冻存与解冻复苏实验 实验目的 了解细胞冻存与复苏的原理。 掌握细胞冻存复苏的常规操作。 实验原理 在低于-79℃的超低温条件下，细胞内部的生化反应极为缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料温度降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应又可恢复正常。 实验仪器及试剂 材料：腹水瘤细胞 试剂： 1、RPMI1640培养液：含10%小牛血清。 2、冻存保护液1：含10%甘油RPMI1640培养液。 3、冻存保护液2：含10% DMSO的RPMI1640培养液。 4、 0.4%的台盼蓝生理盐水溶液。 用品：普通低温冰箱、-70~-80oC超低温冰箱、 10mL低速离心机、水浴锅（37℃） 细胞计数板、细胞冻存管、Parafilm封口膜、细胞冻存盒、1000μL及10μL枪、1000μL枪及10μL枪对应枪头、计数用盖玻片等 实验步骤 冻存操作 1、收集细胞。 2、分别用培养液和两种冻存保护液重悬细胞，转入经检查无破裂的冻存管中。 3、封口。 4、写标签。 5、冻存。4 ℃冰箱20～30 min；-20 ℃冰箱20～30 min；-80℃冰箱中或液氮罐中。? 复苏操作 1、复温。从液氮中取出冻存管，立即投入37 ℃温水中快速晃动1～2min，直冻存液完全溶解。 2、洗去冻存保护液。将细胞冻存悬液移入带盖离心管中；加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；1000rpm离心5min，弃上清液。 3、检查细胞活率。用1ml培养液重悬细胞，台盼蓝染料排除法检查细胞存活率。 实验结果 冻存Ⅰ冻存Ⅱ活细胞数630死细胞数1318生理盐水和培养液中没有观察到细胞。 实验分析 冻存液中细胞存活率：冻存Ⅰ：6/(6+13)=0.316 冻存Ⅱ：30/(30+18)=0.625 可以看出，冻存液Ⅱ中的细胞存活率更高，说明冻存液Ⅱ的冻存效果更好。 生理盐水与培养液对细胞不起保护作用，所以细胞都死了，而且在进行前面的离心等步骤的时候，由于它起不到保护的作用，所以使死细胞都变成了碎片，在离心时被去除了，所以视野当中没有被染成蓝色的死细胞。 在显微镜下观察到死细胞呈蓝色，而且体积比??细胞大，而濒临死亡的细胞的体积则更大。 实验注意事项 塑料冻存管在使用前要仔细检查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封不严。 用DMSO作为冻存保护剂时，用前应先将冻存液在4℃预冷，解冻后应马上洗去保护剂。 DMSO有剧毒，使用时要特别注意。此外，在冻存前越晚加入细胞越好，解冻后要尽快除去，以避免对细胞的毒害。 如用液氮冻存，应注意以下几点： 在液氮罐存取细胞样品时要注意防护，以免冻伤。放细胞时最好带布手套防护手，打开液氮罐时头应偏向一边防护脸；加液氮时要全面防护好眼、手、脚等身体暴露部位；打开液氮罐时要慢，防止液氮突然气化太多喷出。可先开一个小口，待气跑出一部分后再逐渐开大。 在液氮罐放置样品时应间隔一定距离，系线要沿罐口顺序摆放，以免互相缠绕取拿不便。 液氮量要经常检查，如发现液氮挥发一半时要及时补充。