(参考)2012-住院医师讲课-朱晓丽要点.ppt

免疫组化染色技术及其应用 复旦大学附属肿瘤医院病理科 朱晓丽 病理诊断方法 光镜HE 电 镜 免疫组化 分子病理 免疫组化的优点 高度特异性 敏感性高 方法步骤统一 形态、机能和代谢密切结合 免疫组化原理 用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测 抗体的基本结构 抗体类型 多克隆抗体（Polyclonal Antibodies） 抗原（antigen)→羊，马，鼠，兔，鸡 ↓ B淋巴细胞产生IgG ↓ 动物血清纯化 ↓ 特异性 IgG （约1–10 mg/ml） 抗体类型 鼠单克隆抗体（Mouse Monoclonal Antibodies） 抗体类型 兔单克隆抗体 （Rabbit Monoclonal Antibodies） 常用方法 ___直接标记法 适用于： 高亲和力抗体 高密度抗原 (10 K molecules/cell) 常用方法___间接标记法 适用于： 敏感性更高 低密度抗原(2 K, 10 K molecules/cell) LAB法（标记生物素－抗生物素技术） ABC法（抗生物素－生物素－过氧化物酶复合技术） 聚合物-共轭技术 （EnVision，DAKO） EnVision两步法 步骤 将4～5μm 的石蜡组织切片进行常规脱蜡脱水 置0.01M pH6.0 柠檬酸中，100℃修复抗原10分钟，保温10分钟 滴加一抗（根据产品说明书做相应稀释）50~100 μl 于切片上，切片放置在湿盒内，4 ℃冰箱过夜反应 TBS洗涤3次，2分钟/次 滴加二抗于切片上，37℃反应1小时 TBS洗涤3次，2分钟/次 DAB显色15～45分钟 待组织呈棕色时终止显色，水洗干净 苏木复染 脱水、透明、封片 免疫组化各环节的注意点 (1) 固定 目的：保持细胞形态和组织结构完整性，不损害细胞内有效成分和抗原活性 10%中性福尔马林 90％的抗原都能在10%中性福尔马林（固定时间约24小时）中室温保存 冰冻切片4oC冷丙酮室温10分钟 切片和涂片 玻片处理 防脱片白胶（Elmer’s Glue)，多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin) 和防脱片剂（APES) 切片厚度4～5μm，平整无皱折或刀痕 涂片均匀，细胞不重叠 脱蜡 务必彻底 内源性酶的阻断 免疫组化各环节的注意点(2) 抗原修复 重要环节 抗原修复方法 物理方法 热修复——微波，水浴，高压 化学方法 蛋白酶消化——胰蛋白酶最常用 抗原修复液 95 oC 0.1M柠檬酸缓冲液 PH6.0 0.5M或1.0M EDTA缓冲液 PH8.0 抗原修复时注意: 切片质量很重要 温度和时间掌握不当会发生非特异性反应 热抗原修复后应注意自然冷却 热处理过程中修复液切勿煮干 有些抗原不一定需要进行抗原的修复 免疫组化各环节的注意点(3) 第一抗体 最关键环节 一抗稀释度（浓缩型抗体） 根据抗体说明书的稀释范围找出最佳稀释度 一抗孵育时间、温度 4℃ 冰箱 过 夜 37℃温箱/常温 2小时 抗体的正确保存 －20℃或4℃冰箱保存 免疫组化各环节的注意点(4) 第 二 抗 体 1）一抗种属来源  主要根据一抗种属来源来决定确定二抗的类型，如一抗是小鼠来源,? ? ? ?那二抗就买抗小鼠的即可（如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可） 2）一抗类型  二抗需与一抗的类别或亚类相匹配,通常针对单克隆抗体而言 ? ? ? 一抗 二抗 多克隆抗体 (IgG类免疫球蛋白)