酵母转化PEG LiAC法.pdfVIP

酵母转化 (一) 原理： 我们采用的是PEG/ LiAc 法转化酵母。 PEG 是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的PEG 才会发挥最大的 转化促进作用。本文使用的PEG 分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达 3 5 到10 ～10 cfu/ μg 。PEG 在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜, 减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤, 同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG 的 浓度是务必适宜,这一点很重要。 LiAc 可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性 DNA 。 鲑鱼精担体DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被 DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。 在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精担体DNA 在转化实验体系中以单链形式存在 (二) 材料、仪器设备及试剂： 1. SD 培养基： YNB ： 1.6 g/L 硫酸铵：5g/L 氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加 调节pH=5.8 ，121°灭菌15min 2. YPDA 培养基 胰蛋白胨 20g/L 酵母浸膏 10g/L 琼脂 20g/L( 固体) 腺嘌呤 15ml 0.2% 腺嘌呤/ L 调节pH =7.5 ，121°灭菌15min 3. 0.9%NaCl （w/v ） NaCl: 0.9g milipore 水 定容到100ml 灭菌121°，20min 4. 100%DMSO 从试剂瓶中分装到ep 管中，500ul 每管，室温保存 5. 10 ×TE （pH=7.5 ）： （0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） Tris-HCl 1.211g/100ml EDTA 0.37g/100ml 调节pH=7.5, 121 °，20min 6. 10 ×LiAc （pH=7.5 ） 1M LiAc 10.202g/100ml 用醋酸调节pH=7.5 ，121°灭菌20min 7. 1.1 ×TE/LiAc Tris-HCl 11ml 10 ×LiAc （pH=7.5 ）/100ml EDTA 11ml 10 ×EDTA （pH=7.5 ）/100ml 调节pH=7.5, 121 °，20min 8. 50% PEG3350： PEG3350 ： 50g 已灭菌的milipore 水： 定容到100m （可用50°水浴助溶，PEG 易吸水，不可灭菌） 9. PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep 管或50ml 离心管中 终浓度 10ml PEG3350 40% 8ml 50%PEG3350 TE buffer 1 × 1ml 10×TE LiAc 1 × 1ml 10×LiAc 10. 变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml) 11. milipore 水，70%酒精棉球，50ml 离心管4 个，ep 管一盒，15ml 试管架，50ml 试管 架，ep 管架 (三) 具体方法： A：酵母感受态制备 1. 从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA 平板上划单克隆，30 °培养3 天左右。 2. 从平板上分别挑取单克隆（直径