实验室猪精液品质检测新技术 - 中国种猪信息网—种猪 养猪 ....pptVIP

精子密度检测 估 测 法 精子密度仪法 和CASA 法 血细胞计数法 主观性强，误差大 ＜一个精子为“密” ＝一个精子为“中” ＞一个精子为“稀” 最准确，但速度慢 滴上1滴稀释精液 原精液200μL 3%NaCl稀释10倍 计数板上放盖玻片 计数5个中方格精子 将该数乘以50万 方便、时间短、重复性好 猪精子密度一般为2~3亿/ml 生产上主要以精子密度仪法检测 精子畸形率检测 取中层精液抹片 固定液固定20min Giemsa染色90min 水洗并风干 置1000倍油镜下 观察精子＞ 300个 畸形率检查方法 相差显微镜直接观察 伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察 畸形率要求 染色后显微镜观查 影响：畸形率过高会减少精液的受精能力 要求：一般要求不超过18%为宜 改善：增加精液的用量可以提高其受精效果 精子质膜完整性检测 精子质膜染料分类 精子不同区域质膜的检测 目前主要的精子质膜检测方法 精子质膜作用及分布 1 2 3 4 精子质膜作用及分布 维持完整的 细胞内环境 受精过程中起到信 号识别与传导作用 转运物质功能 覆盖于顶体外 膜区上的质膜 覆盖于精子头部 非顶体区的质膜 覆盖于尾部的中段 和主段部分的质膜 作用 分布 精子 质膜 染色原理：此种染料不能进入质膜完整功能的精子内部，只能进入质膜受损的精子，并与DNA结合发出荧光。 染色原理：活精子特异的荧光染料是膜通透性的染料，只能进入细胞膜完整的精子。 Hoechst33342 SYBR-14 羧基荧光素双醋酸盐 (CFDA) 羧基二甲基荧光素双醋酸盐(CMFDA) Carboxy-SNARF-1 SYTO-17 荧光染料 死精子特异性荧光染料 活精子特异性荧光染料 非荧光染料 伊红—苯胺黑染色 伊红—苯胺蓝染色 苔盼兰—吉姆萨染色 碘化丙锭（PI） Hoechst33258 溴化乙锭（EB） 溴乙啡锭二聚体（EthD-1） Yo-Pro-1 质膜染料分类 精子质膜染料分类 精子不同区域质膜的检测 覆盖于顶体外 膜区上的质膜 覆盖于精子头部 非顶体区的质膜 覆盖于尾部的中段 和主段部分的质膜 荧光染料，例如碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）、DAPI、 Hoechst 33258等 非荧光染料，例如伊红—苯胺黑染色、伊红—苯胺蓝染色等 精子的低渗肿胀实验（HOST）检测 通常与顶体外膜完整性的检测联合起来进行 原理：低渗溶液中，有生物活性的精子质膜会使水分子进入质膜中，直到精子内外环境达到平衡为止。水的内流使精子尾部的质膜膨胀并且尾部会发生弯曲。但是精子质膜损伤或失去生物活性，水能够自由通过质膜，在胞质内不会积聚液体从而不会出现肿胀和尾部弯曲。通过相差显微镜可以观测到精子质膜对低渗液的反应。 精子质膜检测方法 利用显微镜进行检测 Ａ Ｂ Ｃ Ａ：被PI染色的死精子，为红色； Ｂ：被SYBR-14染色活精子，为绿色，膜功能完整； Ｃ：被SYBR-14／PI染色，绿色为膜完整的活精子， 　　红色为死精子。 红箭头所指区域为被PI 　染色的死精子； 蓝箭头所指区域为被 　SYBR-14染色活精子； 利用流式细胞仪检测 线粒体功能检测 精子线粒体检测方法 检测线粒体的染料分类 1 2 检测线粒体的染料分类 染料名称 染色特性 优缺点 R123 （Rhodamine123） MITO （MitoTracker Green FM） JC-1 （5,5,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine iodide） 能渗透并沉积在正常线粒体上发出绿色荧光。如果线粒体损坏则不发绿色荧光。 MITO 在水溶液中不发荧光，而当积聚在线粒体内时会发绿色荧光。 线粒体膜电位低时，发绿色荧光；膜电位高时发橙色荧光 在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。 MITO在精子头部有非特异性染色。 J C-1 染色的特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。 精子运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供 精子线粒体检测方法 检测方法： 荧光显微镜 流式细胞仪 最适合的荧光染料：J C-1 荧光显微镜检测： a： R123染色，在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。 b： J C-1 染色，其特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。 c： MITO染色，在精子头部有非特异性染色。 流式细胞仪检测： A：R123/PI染色，箭头指发绿色荧光精子； B： J C-1 /PI染色，顶端箭头指发橙色荧光精子；底端箭头指发绿色荧光精子； C： MI