WesternBlot(个人版)讲述.doc

 PAGE 10 Western Blot 实验方法 一 蛋白提取 1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。 2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul蛋白酶抑制剂 混匀机混匀。 每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time --pulse--AMPL- -start--O）5s停5s循环1min ,振幅25%（AMPL参数） ,再裂解30min 。 于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。 用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。 (4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的 ，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。 测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。比色皿水洗+酒精洗。 建Excel： （一）Cx=Ax/A标。C标（C标=10ug/ml ,由30ul稀释至40ul, A标已经知道的 ） （二）一般上样量为：30ug, 故: 30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml） 由（一）（二），得：V上样=A标/Ax .4 二 配胶 提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶： 10％分离胶 5％浓缩胶 10ml(两快板) 15ml(三快板) 4ml (l两块板) 6ml(三块板) H2O 4.0ml 5.9ml 2.7ml 4.1 ml 30％丙稀酰胺 3.3ml 5ml 670ul 1.0 Tris-HCL 2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml 0.50ml（1.0M，Ph6.8） 0.75ml 10％SDS 100μl 150ul 40μl 60ul 10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl 150ul 40μl 60ul TEMED（加速剂，灌胶前加入） 4μl 6ul 4μl 6ul 2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。 3、制好胶的玻璃板，仔细观察可以看到一条水平的折线，如若不用，浸泡在电泳液里。 三 上样及电泳 电泳液的配制：up水（1000ml）,tris(3.03g),甘氨酸（18.8g）,SDS （1.0g）. 将两块配好胶的玻璃板薄面相对，夹好（注意对齐，防止漏液），中间倒入电泳液（注意拿错电泳架，分为：有电机的和无电极的），一般两块板的电泳液加到下面的线下面，四块板就加到上面线的刻度下。 3、若电泳液不渗漏，即可拔去梳子（注意两边同时用力，平整拔出）。 4、按上样量点样，每块板子第一孔为Mark（上样量为8-10ul），后面为样品，不用样品间换枪头。 5、将点好样的胶板放入电泳槽，槽内加适量电泳液，注意正负极连接. 6、打开开关，调整电压(80V)、电流（250mA）时间(30min)，开始电泳,结束后，调节电压（110V）、时间（60min）。 四 转膜 1、转膜液的配制：up水（800ml）,tris(3.03g),甘氨酸（14.4g）于40C置于冰箱，