2016-5基因工程及其应用教程.ppt

一 基因工程概述 二 基因工程工具酶 三 克隆载体 四 微生物作为克隆载体的宿主 五 基因工程的常用技术和方法 第5章 基因工程及其应用 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（重组DNA 技术）；下游技术涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养及基因产物的分离纯化过程。 基因重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 供体、受体和载体是重组DNA技术的三大基本元件。 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种 基因工程的目的： 大规模生产生物活性物质 工程细胞 基因工程 蛋白质工程 途径工程 发酵工程 细胞工程 分离工程 酶 酶工程 分 离 工 程 天然细胞 天然细胞 生物活性物质 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程 一 基因工程育种 是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优良性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。 基因克隆过程： １、获得待克隆的DNA片段（基因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与／或表达。 二 基因工程常用的工具酶 基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。 包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等。 限制（restriction)与修饰 (modification) 体系(R/M )： 寄主是由两种酶活性配合完成的: 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶 E. coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E. coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E. coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。 R/M体系的作用： ⑴保护自身的DNA不受限制； ⑵破坏外源DNA使之迅速降解。 1、核酸限制性内切酶的分类 I 型限制酶的基本特点: 　　　反应必须S-腺苷基蛋氨酸、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋，有特异识别位点但没有特异切割位点，切割是随机的。如EcoB和EcoK II 型限制酶的基本特点： 　　　反应必须ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特异性识别部位并切割。 如EcoR I、Hinf III III 型限制酶的基本特点： 可以识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24-26bp处切开DNA，切割位点没有特异性。 （一） 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 2、限制性核酸内切酶的命名原则 第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。 形成粘性末端； 形成平末端； 3、限制性内切酶作用后的断裂方式 粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。 Sel I CGCG Tha I CG CG Sau3A I GATC CTAG BamH I GGATCC