构建重组表达质粒pBV220mhNT-4.PDFVIP

第1卷 第4期 中国科技论文在线 SCIENCEPAPER ONLINE 2006 年 11 月 263 构建重组表达质粒 pBV220／mhNT-4 及 mhNT-4 在大肠杆菌中的表达 张 华1，赵家良1，胡海涛2 （1．中国医学科学院北京协和医院眼科，北京 100730； 2．西安交通大学医学院神经生物学中心，西安 710061） 摘 要：利用基因重组技术将 mhNT-4 亚克隆到表达载体 pBV220，构建重组表达质粒 pBV220／mhNT-4，诱 导 表达 mhNT-4 成熟蛋白，鉴定 mhNT-4 的生物活性。将经鉴定的 pGEM-T Easy /mhNT-4 克隆用限制性内切酶 EcoR I,BamH I 消化，琼脂糖凝胶电泳回收片断。酶切原核高表达载体 pBV220，用限制性内切酶 EcoR I,BamH I 消化， 琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体。用 T4 DNA 连接酶连结两个回收片断，构建重组质粒 pBV220／mhNT-4。限 制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。经鉴定的重组质粒 pBV220／mhNT-4 转染大肠杆菌 DH5α， 温度诱导表达 mhNT-4 蛋白。SDS-聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳技术分离表达的 mhNT-4 蛋白。制备 8~9d 鸡胚，分离并培养背根神经节(DRG)细胞。分别加入回收的表达蛋白和牛血清白蛋白，培养鸡胚背根神经节 DRG 细胞，检测 mhNT-4 生物活性。重组表达质粒 pBV220／mhNT-4 构建正确，表达框架未发生改变。成功诱导表 达、分离了 mhNT-4 成熟蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出，对照 组未见神经突起长出。mhNT-4 成熟蛋白具有良好的生物活性。本研究为进一步开展 mhNT-4 基因治疗青光眼提 供了资料。 关键词：人神经营养素-4 成熟蛋白基因（mhNT-4）；基因重组；表达载体；生物活性 中图分类号：R96 文献标识码：A 文章编号：1673–7180(2006)04–0263–6 青光眼是一种严重的致盲性眼病，是一组与视 在以前的研究中，我们课题组已成功地从中国人 野缺损有关的具有特征性视神经病变的眼部疾病， 白细胞中克隆NT-4 全长基因[8]和成熟蛋白基因[9]。本 以高眼压为危险因素之一。青光眼的视神经病变和 文从中国人白细胞中成功地克隆人神经营养素-4 视野缺损，与视网膜神经节细胞及其轴突在视网膜 成熟蛋白基因（the matured human neurotrophin-4， 和视神经缺损相关，阐明视网膜神经节细胞死亡过 mhNT-4）并成功构建重组了真核表达质粒pBV220/ 程中的细胞分子变化是目前一个活跃的研究领域， mhNT-4，为今后研究在原核细胞中的表达，进一步 正被广泛应用于视网膜神经节细胞衰亡的机制研究 开展青光眼基因治疗创造有利条件[7，10-11]。 中，并将为青光眼治疗带来新