鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验.docx

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Awes试验) 一目的 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验是检测原核生物(细菌)回复突变的遗传毒理学体外试验， 遗传学终点是基因突变，用于检测受试物能否引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码 突变。本试验是美国加州大学Ames教授发展的，故称Ames试验。 二原理 利用鼠伤寒沙门氏菌(SaJ.monella typh}murium)的突变型即组氨酸缺陷型(hi sv)， 作为指示生物。这些菌株在无组氨酸的培养基上不能生·长，在有组氨酸的培养基上可以正 常生长。致突变物可使沙门氏菌突变型回复突变为野生型(hi s})，恢复了合成组氨酸能力， 因而在无组氨酸培养基上也能生长为可见的菌落。故可根据在无组氨酸的培养基上菌落生 成数量，检查受试物是否为致突变物。对于间接致突变物，可用经Aroclor1254(或多氯联 苯))诱导的大鼠肝匀浆制备的S9混合液作为代谢活化系统。 正向突变 眼伤寒沙门???苗原养型}113} 一------一卜 气}}} 组氮酸营养缺陷型突变株(hiss !士S9代谢活化系统 受试物 三仪器和试剂 I.低温高速离心机，低温冰箱(-80 0C)或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴， 蒸气压力锅，匀浆器等实验室常用设备。 培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当 保存温度和期限。 2.培养基制备_ C1)营养肉汤培养基 牛肉膏2. 5g 胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g 氯化钠2. 5g 磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g 蒸馏水至500mL 加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基: 凉脂粉 营养肉汤培养基 加热融化后调pH为7. C3)底层培养基 用于基因型C rfa突变， 2. 0g R因子，P}Q1 ...，份，卜州‘闷，r闷. 质粒，△ urvB)鉴定。 100mL 4, 0. 103MPa 20m i n灭菌。 1)磷酸盐贮备液(V--B盐贮备液) 磷酸氢钠铁(NaNH,HP04)43 .8g 柠檬酸(C}Ha07 .H20 ) }5g 磷酸氢二钾(Ka HPO,) 1fi3. bg’ 硫酸镁(MgSO,’7H20) 2. 5 g 加蒸馏水至500mL，0. i 03 MPa 20m i n灭菌 待其他试剂完全溶解后，再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。 2 ) 4096葡萄糖溶液 葡萄糖‘40. 0g 加蒸馏水至140mL，0.055 MPa 20min灭菌 3)底层培养基 1. 596琼脂培养基 琼脂粉’6. 0g一’- 蒸馏水400mL 融化后0. 103MPa 20min灭菌。趁热(80C )，在灭菌琼脂培养基中(4QOm1)依次无 菌操作加入; 磷酸盐贮备液8mL 409b葡萄糖溶液..20mL 充分混匀，待凉至80℃左右时倒平皿，每皿，(} 90mm ) 25 mL= 37℃培养过夜以除去 水分及检查有无污染。(4)顶层培养基 1)顶层琼脂 琼脂粉一.0. fig 氧化钠‘0. 5g 加蒸馏水至100 ml 2 ) 0. 5mmo1/L组氨酸一生物素溶液(诱变试验用) D-生物素(分子量244 ) 30. 5mg L一组氨酸(分子量155 ) 17. 4mg 加蒸馏水至250mL 3。鉴定菌株基因型用试剂 (1)D. Imo 1 /L组氨酸/0.02moI/L D一生物学素溶液(鉴定菌株用， 称取L一盐酸组氨酸(MW191. 17 )191. ?mg，D一生物素I2. Zmg，溶于 2Dmin灭菌，保存于4C冰箱. 无菌配制) 14mL蒸馏水，0. 103MPa (2)0. 8}6氨节青霉素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)称取氨节青霉素40mg，用0. 02mo1/L 氢氧化钠溶液5毗溶解，保存于4C冰箱。 (3) 0. 8%四环素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)称取40mg四环素，用0. 02moZ/L盐酸SrnL 溶解，保存于4}C冰箱。 }4) 0. }%结晶紫溶液(鉴定菌株用)称取结晶紫0. } g,溶于IOOmL蒸馏水。 4.活化系统的制备 }l)大鼠肝S9的诱导和制备:选健康雄性成年SD或}istar大白鼠，体重i50g左右，周 龄约5-fi周。