酶工程原理及应用-03 酶的分离提取及纯化制备.pptx

酶工程 (原理及应用);第三章 酶的分离提取及纯化制备;一、分离技术的基本原理及策略;分离技术的基本原理;生物分离的基本过程;生物分离的各阶段的常用方法;生物分离技术的特点;分离纯化方法选择的基本原则;;分离效率的评价;分离因子(separative factor)， 或分离系数(separative coefficient) 意义：A、目标产物浓度?，杂质浓度?，则分离因子大，分离效率?； B、? = 1时，则未分离。故在分离为主要目的时,? ? ? ;回收率(recovery)：;生物分离方法的选择;成品规格（或产品质量标准） 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25? ~ -29? 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 1.12-1.22 ???基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，% 0.5 ?进料的组成和物性 (1)目的产物的浓度。高？低？ (2)物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。 (3)目的产物的定位。是胞内还是胞外？ (4)菌种的种类和形态。 (5)微生物的含量和发酵液的黏度。;生产规模 危害性 (1)离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。 (2)目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。 (3)试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。 (4)微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。 分批分离还是连续纯化;16;酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。;二、常用的提取技术原理及应用;1、预处理和固液分离 分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)。 除去部分可溶性杂质。 改变滤液的性质（降低粘度等），以利于后继操作。;（1）发酵液的预处理;（2）发酵液的凝聚和絮凝处理;有机高分子聚合物絮凝剂具有长链线状结构，是水溶性聚合物，分子量高达数万至一千万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷，也可以不带电性。 它们通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。 聚丙烯酰胺类衍生物 聚苯乙烯类衍生物 无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。 天然有机高分子絮凝剂：多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖等。;絮凝剂浓度 絮凝剂分子量 絮凝剂类型 溶液的pH 搅拌速度和时间 助凝剂;（3）发酵液的过滤;2、细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。;27;28;29;30;31;;机械破碎法;采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。;35;36;37;38;高速珠磨机工作原理;Netzsch LM-20型珠磨机;珠磨机破碎作用方程;42;43;44;45;47;48;使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质;50;51;52;53;54;55;56;57;58;59;60;61;62;二. 化学法—冻融法结 加B.A(12%,37℃搅拌3h）→ 菌悬液→冻融(冻结14h→融化)，释放率—70%；比活—2.69 u/mg 三. 化学—超声波振荡法结合 先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72%。小型设备，不能工业大规模生产。 四. 高压匀浆法