荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测.pdfVIP

四JII动物 2014年 第33卷 第5期 SichuanJourn~ofZoology Vo1．33 No．5 2014 DOI：10．3969／j．issn．1000—7083．2014．05．004 荒漠 昆虫小胸鳖 甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测 陆雪莹，李洁琼，庄淑珍，刘小宁，马纪 (新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046) 摘要：目的 几丁质酶是昆虫重要的防御物质，本研究采用 DNA一蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲 几丁质酶(MpCHI786)的抗血清，用于检测小胸鳖甲在外界不 良条件下几丁质酶的变化。方法 从小胸鳖甲成虫中 提取总RNA，反转录后 RT—PCR扩增Mpchi786cDNA，构建原核表达载体 pET30a—Mpchi786，在大肠杆菌BL21中用 IPTG诱导表达获得融合蛋白His—MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外 ，构建真核表 达质粒pcDNA3．0一Mpchi786，对小鼠尾静脉高压注射，8h后 RT—PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3．0-Mp． chi786肌肉注射免疫小鼠3次后，再用 His—MpCHI786融合蛋白加强免疫2次，DNA免疫和免疫结束后收集免疫小 鼠的血清，ELISA和Westernblot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT．PCR结果显示尾静脉高压注射8h后 ， pcDNA3．0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Westernblot检测表明，用His—MpCHI786融合蛋白作为抗原 ， pcDNA3．0．Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和 His—MpCHI786融合蛋 白加强免疫2次后的抗血清都显示了特 异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达 1：204800以上。结论 利用DNA一蛋白质联合免疫法能够获 得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。 关键词 ：小胸鳖甲；几丁质酶；DNA一蛋白质联合免疫；抗血清；抗体效价 中图分类号：Q951．819；Q966 文献标志码：A 文章编号：1000—7083(2014)05—0659一O6 PreparationandTiterAssayofAntiserum againstChitinaseMpCHI786 from theDesertInsectM icroderapunctipennis LU Xueying，LIJieqiong，ZHUANGShuzhen，LIU Xiaoning，MA Ji (XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering，CollegeofLifeScienceandTechnology， XinjiangUniversity，Urumqi830046，China) Abstract：Objective Chitinaseisoneoftheimportantdefensivematerialsininsect．Thisstudyaimsatpreparationof theantiserum againstchitinaseMpCHI786from thedese~ insectMicroderapunctipennisbyusingDNA prime—proteinboost immunizationstrateyg todetectthechangesofchitinaseinM．punctipennisunderadverseenvironmental conditions．M ethods TotalRNAwasextractedfrom adultM．punctipennis．andthenreversetranscribedtoobtainthetotalcDNA．ThecDNA