微生物综合实验2.pptVIP

微生物学综合实验（二）;微生物学综合实验（二）;第一阶段：分组---选题---制定实验方案;第一阶段：分组---选题---制定实验方案;第一阶段：分组---选题---制定实验方案;第二阶段：菌株筛选---分离纯化---菌落形态观察;海洋细菌的特点：;海洋细菌的常用培养基：2216E海洋细菌培养基 (Zobell，1941);样品的采集;南森采水器：可以采取海洋不同深度的若干个水样，同时测定各水样所在水层的水温。 ;装有海水样品的离心管在超净工作台中处理;选择合适的培养基;菌种的分离纯化;平板分区划线分离法（左）及培养后菌落分布示意图（右） ;形态观察：;形态观察：;形态观察：;形态观察：;第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征;甘油冷冻保藏法;画蛇形线 菌种保存管;第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征;第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征;温度实验;盐度实验;TCBS生长试验; 鉴于部分生理生化实验培养基的配置要求较高，且不易观察实验结果。 因此部分实验采用API试剂条进行。;API鉴定系统;API组成; ①发酵试验：为碳水化合物与酸的分解代谢试验 ，结果 是通过 PH的变化引起酸碱指示剂颜色的改变来判断。如葡萄糖、乳糖 、甘露糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨醇等。 ;②同化试验：根据待测菌能否利用反应杯中的单一碳水 化合物作为碳源而得以生长来判断。如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N一乙酰葡糖铵、葵酸、乙二酸、苹果酸等。 ;③酶试验：根据待测菌含有相应的酶就可分解底物，再 通过显色反应来判断。如碱性磷酸酶、氧化酶、β一半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、吲哚产生等。 ; ④其它生化反应 ：如硝酸盐还原酶、七叶苷、明胶、硝酸盐还原等。 ;API种类;API种类;API种类;API 20E - 肠道杆菌科於环境中及动物产品中非常普遍其中部份是致病性(沙门氏、耶尔森氏) - 常规鉴定中的标准 - 其他新鉴定系统比较的金标准 - 方便使用，24小时出报告;;API 20 E;利用传统生化及发酵反应作肠道杆菌鉴定 肉眼判读;Aeromonas (气单胞菌属) (3) Plesiomonas (邻单胞菌属) (1) Vibrio (弧菌) (7) Pasteurella (巴斯德氏菌) (3) Chromobacter (色杆菌) (1) Chromobacterium (色杆菌属) (1) Pseudomonas (假单胞菌属) (5) Burkholderia (伯克霍尔德菌属) (2) Chryseomonas (金色单胞菌属) (1) Chryseobacterium (金色杆菌属) (2) Flavimonas (黄色单胞菌属) (1) Xanthomonas (黄单胞菌) (1) Acinetobacter (不动杆菌属) (1);;API 试剂盒及其配套试剂 (API 20E);操作步骤 1 (API 20E);操作步骤 2 (API 20E);操作步骤 3 (API 20E);阅读结果;API试剂条; API 试剂盒使用 由指导教师指导，每个小组提供API 20E 试剂条一个，每个小组选取两株菌进行鉴定。 ;第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征;第四阶段：分子鉴定----生物信息学分析;PCR模板的制备：在2216E培养基上培养了48h的细菌培养物，接种环挑取菌落，到20ul无菌水中，制备成菌悬液，沸水浴十分钟后，立即放入冰浴中冷却使菌体破裂，10000r/m离心10min，收集菌体，-21℃保存。 ;PCR反应体系;PCR反应循环参数：;PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定;PCR扩增产物经电泳检测后，直接交测序公司进行纯化和序列测定。将测定的基因序列运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16SrDNA核酸序列进行相似性比较分析。 ; 1、每人选取1株细菌进行PCR扩增，测序。 2、愿意将序列提交到GenBank数据库的同学，??导教师辅导序列提交。; 1、每周选一个时间，大家都来实验室，检查交流实验情况。 2、除上面约定时间外，指导教师每周一下午2:30来实验室，平时随时可以到206咨询。