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高分子杂质的检查;检查高分子杂质的意义;高分子杂质的含义及分类;三种主要分离模式;一.凝胶过滤色谱法;凝胶色谱法原理;;色谱柱;Kav即有效分配系数：表示分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。 Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关： Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) 在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。;后来又有人使用Sephadex LH－60 ，虽然对PL－385 无吸附作用，但因Sephadex LH－60 分离度低,因此也不用于分离聚合物。 总之，以上报道的分离、分析方法因操作繁琐,实验误差大等原因,难于满足质量控制的需要。 因此，近期的报道中主要采用葡聚糖凝胶SephadexG－10 填料,其分子排阻量为700 道尔顿(葡聚糖) 。 ;Sephadex G-10 葡聚糖凝胶分子结构;(1)葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是指由天然高分子－葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech 生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex 系列，它是葡聚糖与3－氯－1，2环氧丙烷(交联剂)相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex 中排阻极限最大的G-200为8×105。;;Sephadex 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex 稳定工作的pH 一般为2~10。 但酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex 与强酸和氧化剂接触。 Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。 ;胡昌勤等运用葡聚糖凝胶Sephadex G－10 分离分析β－内酰胺抗生素中的高聚物并进行了一系列的报道，阐述了各种色谱条件对β－内酰胺抗生素在Sephadex G－10 凝胶色谱系统中色谱行为的影响,指出: 溶质的解离主要与流动相中缓冲盐的种类和浓度以及pH值有关,具体如下：; ①当流动相中离子种类不变,离子强度越大,β－内 酰胺抗生素的Kav 值越大; ②缓冲液中的阴离子种类,阴离子所带的负电荷越多,溶质的Kav 值相对越大,色谱峰越易拖尾; ③当流动相中有多元酸/ 盐存在时,pH 通过影响多元酸的解离,改变缓冲液中阴离子类型来改变溶质的保留行为; ④流动相的pH 也可通过影响溶质的解离状态来影响溶质的保留行为。对侧链中含有氨基的溶质,流动相的pH 可直接影响氨基的质子化状态。在酸性条件下氨基主要以NH3+ 的形式存在,在碱性条件下氨基主要以NH2 的形式存在, ;报道中还指出了β－内酰胺抗生素在Sephadex G－10 凝胶色谱系统中，色谱行为的定量关系; 有目的地利用了溶质与 Sephadex G－10 凝胶介质间的相互作用在凝胶颗粒内、外有较大差异这一现象,通过选择适当的流动相使β－内酰胺抗生素和其高聚物达到分离。 ;同时其利用在特定情况(纯水、0. 5 % 葡萄糖溶液或0. 01mol/ L 甘氨酸溶液为流动相时－－即药典上所说的流动相B)β－内酰胺抗生素可以缔合形成表观分子量较大的缔合物,缔合物在Sephadex G－10 凝胶色谱系统中色谱行为和高分子杂质一样,Kav = 0 处表现为单一色谱峰这一特点,采用了自身对照外标法对高分子杂质进行精确定量,解决了无高分子杂质对照品和溶质主峰十分宽大(如下图),致使一般积分仪难于准确积分的问题。 ;图1 高分子聚合物峰形图 Fig 1 The peak of high molecular weight impurities;中国药典从2000 年版起收载头孢哌酮钠、头孢曲松钠、头孢他定、头孢噻肟钠四个品种高分子聚合物的测定,方法均采用Sephadex G－10 自身对照外标法；而中国药典2005版在此基础上又增加了头孢拉定、头孢呋辛钠、头孢唑啉