药物对肺癌细胞的作用.docVIP

2012-07-10 14:41 多西他赛与吉非替尼对人肺癌细胞的作用 来源： HYPERLINK  　　多西他赛和吉非替尼均是晚期非小细胞 HYPERLINK /cancer/feiai/ 肺癌( non-small cell lung cancer, NSCLC)的一线和二线治疗药物，日前两者疗效都达平台期。除寻找新的靶向治疗靶点外，如何进一步提高化疗和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EG FR-TKIs)的疗效是晚期NSCLC面临的问题。化疗药物与EGFR-TKIs作用的机制不同，理论上两者同时应用可能有增效作用。细胞学研究显示，EG FR-TKIs联合化疗药物能明显增强对NSCLC细胞生长的抑制作用，起到“1+12”的作用川。但是，多项大型临床研究INTACTl }2} ,INTACT2}3}、TRIBUTE}4}和TALENTS均显示EGFR-TKIs与化疗同时作用在有效率及生存期方面并未优于单独化疗，且无疾病进展时间和疾病控制率未能提高。上述结果引发了两个问题:(1)对于EGFR-TKIs与化疗同时使用是否一也存“优势人群”‘了例如TRIBUTE研究中EGFR突变患者采用化疗联合厄洛替尼的有效率显著高于野生型( 53 % vs. 18 % , P = 0. 012 ) } ( 2 ) EGFR-TI}I与化疗序贯应用是否具增效作用，序贯应用增效作用是否也存在“优势人群”‘了日本的WJTOG0203 III期临床试验证实，先化疗后序贯吉非替尼能够提高肺腺癌患者的总生存时间[6es。说明化疗联合EGFR-TKIs的增效作用不仅与用药顺序有关，还可能与NSCLC细胞EGFR突变状况有关。因此，本研究的第一个日的是通过观察多西他赛和吉非替尼不同顺序用药对EGFR野生型和EGFR突变型细胞生长的影响，寻找NSCLC细胞不同EGFR突变状况的最佳给药方式。 　　化疗与EG FR-TKIs二者联合应用增效与否的细胞学机制不明。既往研究显示，化疗同时应用EGFR-TKIs不增效的原因可能与细胞周期有关[,H }化疗后序贯应用EGFR-TKIs产生协同增效作用可能与EGFR磷酸化有关[91。近年的研究表明胰岛素 　　样生长因子受体1( IGF-1 R)亦可通过细胞内信号蛋自PI3 K/AKT影响细胞对化疗及EG FR-TKIs敏感性[i o-i i }。因此，本研究的第二个日的旨在通过检测多西他赛与吉非替尼不同时序应用对EGFR野生型和突变型肺腺癌细胞的EGFR , IGF-1 R、下游信号蛋自表达磷酸化影响及细胞周期变化，寻找可能的细胞学机制。 　　材料与方法 　　1. 1材料人肺腺癌A549细胞由中科院上海细胞生物研究所提供，PC-9细胞由日本国立 HYPERLINK 癌症中心小泉史明博士惠赠} }z}。四甲基偶氮哩盐[3- ( 4 , 5-dime-thvlthiazol-2-vl)-2，5-diphenvl-tetrazolium bromide，MTT、二甲基亚矾( DMSO)购自Sigma公司。吉非替尼和多西他赛分别由阿斯利康制药有限公司及江苏恒瑞公司提供，均溶于DMSO中，以5 x 10-3mo1/L-20℃保存。胞外调节蛋自激酶(ERI}1/2)一抗、蛋自激酶B ( AKT)一抗、IGF-1 R一抗、内参((3-actin ) ,磷酸化表皮生长因子受体(p-EG FR)一抗、磷酸化蛋自激酶B ( p-AKT)一抗、磷酸化胰岛素样生长因子受体1( p-IGF-1 R)一抗以及p-ERKl /2均购自Cell Signa-ling公司，表皮生长因子受体(EGFR)一抗购自SantaCruz公司，兔源及鼠源二抗购自Cell Signaling公司，BCA试剂盒购自Pirce公司。ECL化学发光试剂盒购自GE Healthcare公司。DNA提取试剂盒购自天根生物公司。电泳仪及化学发光成像系统购自Bio-Rad公司，酶联免疫检测仪购自Bioce112010公司。流式细胞检测盒购自碧云天公司，流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司。1. 2细胞培养人肺腺癌细胞A549和PC-9置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 ( Gibc。公司)培养 　　液，370a ,5% a02培养箱中培养，细胞单层贴壁生长。实验取用生长状态良好的对数生长期细胞，胰酶消化传代，收集备用。 　　1. 3 A549 ,Pa-9细胞的EGFR和K-Ras基因突变检测将处于对数生长期的细胞，胰酶消化，离心重悬后按基因组DNA提取试剂(TIANGEN)说明操作提取DNA。分别取A549,Pa-9细胞DNA产物8闪进行电泳，1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。细胞E