鲤鱼脑乙酰胆碱脂酶的活性测定.pdfVIP

北京科技大学必修课程 实验研究论文 鲤鱼脑乙酰胆碱脂酶的活性测定 题目： 课程： 生物化学实验 班级： 化生学院生技 1401 作者： 黄凯辉 学号： 鲤鱼脑乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性测定 黄凯辉 [摘要] 建立了以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等 步骤快速制备细胞色素 C 的方法，进而考察了制备蛋白质制品的一般 原理和操作技术。测定细胞色素 C 含量时，其 520nm 处吸光度的标准曲线为：y = 0.7762x + 0.05，R2 = 0.9974；将细胞色素 C 粗品溶 液稀释适当倍数，加入少许联二亚硫酸钠后，在 520nm 下测其吸光度 A=0.210。样品原液浓度 C=1.072 mg/mL；每 500g 心肌碎肉含细胞色素 C=64.0 mg。 [关键词] 细胞色素 C 分离纯化 分光光度法 1 引言 乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase，EC3.1.1.7）存在于动物神经元和肌细胞之间的突上。其功能是 催化神经递质乙酰胆碱的水解，从而终止神经冲动的传递。乙酰胆碱酯酶的性测定在临床上可以作为神 经系统疾病、肝脏系统疾病、重症肌无力、有机磷中毒等的重 AChE 可溶于水或稀盐溶液，因而可将生 物组织及缓冲溶液置于组织匀浆器或组织捣碎机中制备组织匀浆，经离心后，其上清部分可用于测定组 织中 AChE 的活性。 AChE 的活性定方法主要有光学方法和电化学方法。本实验采用分光光度法测定 AChE 活性。其基本原 是乙酰胆碱酯酶催化碘化硫代乙酰胆碱水解，其生成物碘化硫代胆碱与巯基显色剂 5,5-二硫代-双（2-硝 基苯甲酸）（DTNB）反应，生成黄色产物 5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-TNBA），反应方程式如下图所示。 本实验通过测定酶促反应初速度的方法计算酶活性。方法是酶促反应开始后每 30s 测定次吸光度，连续 测定 3min。计算吸光度变化的平均值 ΔA/min。根据波尔定律：A=CξL，每分钟产物浓度的变化值 Δ C=ΔA/ξL。已知 5-TNBA 的 ξ 值为 1.96×105 L/mol?cm，比色杯的光程长 1 cm，因此，ΔC（mol/L ）=ΔA/（1.96×105）。根据酶活性单位的定义：25 ℃，最适 pH 值和最适底物浓度下，酶分钟催化 1μmol 底物所需的酶量为 1 IU，酶活性=ΔC×106 IU。酶的比活=酶活性/总蛋白浓度。 2 实验部分 2．1 试剂和仪器 2.1.1 材料 活鲤鱼。 2.1.2 试剂 硫代-双（2-硝基苯甲酸）5 mmol/L 碘化硫代乙酰胆碱 100 mmol/L 5,5-二 Tris-HCl 缓冲溶液（pH7.4，20mmol/L，含 0.1% Triton X-100 和 0.05mol/L NaCl） 磷酸盐缓冲液（pH7.4，20mmol/L） 考马斯亮蓝 G-250 试剂 2.1.3 器材 冷冻高速离心机，分光光度计，组织匀浆器。 2. 2 乙酰胆碱脂酶的制备 2.2.1 酶的提取 取 1 条活鲤鱼，剪开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝