生化实验技术专题讲解.pptx

生化实验技术专题;目 录;第一章 生物大分子物质的制备;第一节 材料的选择与处理;生物大分子分离纯化的一般步骤和原则;注意事项;一、材料的选择;第二节 确立测定方法; 光谱法 （1）吸收光谱 法 1、 直接测定法 A. 测定核酸含量 当A260=1时 双链DNA 50μg/ml 单链DNA 37μg/ml 单链RNA 40μg/ml A260/ A280 : 纯DNA=1.8 纯RNA=2.0 样品中污染蛋白质或酚类等物质时比值减小;B.测定蛋白质的含量及纯度 A280 的决定性Aa是Trp和Tyr 2、 比色法 P.7 表1-2 将待测物（如蛋白质、核酸、糖类）与相关试剂反应后，根据呈现的颜色或形成的产物特性，移至相应波长的分光光度计测定。 测定的消光值从制作的标准曲线中换算出待测物的含量。 不同消光值之比可鉴定某些物质的纯度 如：细胞色素C 还原型A550/氧化型A280=1.25~1.28 ;（2）荧光法 荧光法的精确性、重复性和灵敏度好过吸收光谱法。 无荧光的物质想法偶联上荧光物质即可。 如：NADH/NADPH 有荧光，通过酶联反应引入荧光物质等都是常用方法 （3） 浊度法 极稀的悬浮液可采用此法测定。即测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。此法亦可用于测定培养液中细菌生长的浓度（A600）。;电化学法 利用反应过程产生的可测物（如：H+、Cl-等） 生物活性检测法 如：激素类物质，通过观察生物体的表现测定 免疫分析法 如：利用抗原、抗体的特异反应，并结合同位素标记或酶标记，可灵敏的定性、定量分析（19章） 生物传感器 用生物传感器中的敏感膜（固定化酶）与待测溶液中的某一物质反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量 （17章）;第三节 细胞的破碎;第四节 抽 提;第五节 浓 缩;超过滤（ultrafiltration）;透 析（dialysis）;第六节 纯化方案的设计与评价;生物大分子分离纯化的一般步骤和原则;二、纯化方案的评价;宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化;第二编 纯化方法第二章 沉淀法;几种主要沉淀方法比较;二、1. 盐 析 法;调整硫酸铵溶液饱??度计算表(25度);（2）盐析曲线制作 a/曲线制作方法 b/确定最佳盐析范围; （3）盐析的影响因子 a/盐析常数 ks ks—表示有效成分溶解度降低的速率与盐浓度之关系 ks值大，说明溶解度降低的速度随盐浓度的增加 而快速降低。其分级范围就窄，盐析效果就好。 它与蛋白质本身的性质、溶液的pH、温度、盐的 种类等有关。 b/盐分级范围的差异性（图2-2） c/pH和盐浓度 调至待沉淀分离物的等电点 d/蛋白质的纯度和浓度（0.2-2%）共沉淀现象 ;（4）脱盐 A/凝胶过滤法 B/透析法 关于透析： a.透析袋的处理 在含EDTA的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，老化后容易破裂。 b.透析液选择 低离子强度中性缓冲液，适量酶的保护剂，防止微生物生长的0.02%叠氮钠(NaN3) c.掌握透析时间 体积比，搅拌与否 检查：硫酸铵—氯化钡（10%） 氯化钠—硝酸银（10%） ;二、2.有机溶剂沉淀法 常用：甲醇、乙醇、丙酮（有机溶剂使溶液极性减小，导致蛋白质表面极性基团排斥内陷，疏水基团外露因而聚集变性沉淀） 用量计算：与盐析饱和溶液法相同 注意：A/低温与预冷