漆酶的固定化,实验方案.docVIP

树脂是工业中使用得比较广泛的材料，它价格低廉、机械强度好、物化性能稳定、容易再生，用作固定化酶的载体将会有很好的发展前景。离子交换树脂是一类不溶也不熔且具有三维空间网状骨架结构亲水性的功能高分子。连接在树脂骨架上的功能基，可通过吸附、共价键、离子键、配位键、交联、微胶囊等形式以及其他手段将酶固定在树脂上，构成固定化酶[65]。树脂D380是一种浅黄色球形大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上带有伯胺基，属于反应性高分子材料。该树脂表面的功能基团-NH2，可以和戊二醛一端的醛基反应生成西弗(Schiff)碱，而戊二醛的另一个醛基可以连接酶蛋白中游离的-NH2，因此达到固定化酶的目的。 2．1实验部分 2．1．1实验仪器和试剂 2．1．1．1．实验仪器 试验中用到的主要实验仪器见表2．1。 气浴恒温振荡器 THZ-92B型 数显恒温水浴锅 HH-S型 电子分析天平 AB204-N型 紫外一可见光分光光度计 VIS-7220G 循环水真空泵 SHI-III型 2．1．1．2．实验试剂 主要实验试剂见表2．2。 真菌漆酶 20u/mg 树脂 D380 戊二醛 分析纯 邻联甲苯胺 分析纯 醋酸 分析纯 醋酸钠 分析纯 碳酸氢二钠 分析纯 碳酸二氢钠 分析纯 氢氧化钠 分析纯 盐酸 分析纯 2．1．2实验方法 2．1．2．1树脂D380的预处理 取一定量的树脂，去离子水浸泡24h，然后用5％HC L浸泡1 2h，洗涤至中性后再用2％的Na0H浸泡1 2h，再次洗涤至中性，最后以去离子水浸泡备用。 2．1．2．2漆酶的固定化 首先，采用两种方法路线固定化漆酶：先用戊二醛交联载体后再吸附漆酶和先用载体吸附漆酶后再用戊二醛交联，分别测定两种方法固定化漆酶的活力，流程见图2．1所示。其中戊二醛浓度为2％(V:V)，加入量为20mL，缓冲溶液为5 mLpH为5．5的醋酸缓冲溶液，酶液为10mL浓度1 mg/mL的稀释酶液。实验结果表明前者效果明显优于后者，因此后续实验均采用此法进行。 漆酶的固定化方法:取适量预处理过的树脂，抽滤去除表面水分，称取1g置于50ml圆底烧瓶中，加入20ml 0.7%(V:V)的戊二醛，在4℃下搅拌反应2h后静置过夜，再用蒸馏水洗涤多次(至少5次)，去掉未交联的戊二醛，然后加入5ml pH为4的醋酸一醋酸钠缓冲液和2mL稀释酶液在振荡器中在25℃振荡反应6h，反应后放在冰箱于4℃下静置一夜，洗涤多次(至少5次)去除未固定化的漆酶，并测定固定化漆酶酶活。 抽滤，洗涤多次 25℃，恒温振荡吸附 抽滤，洗涤多次 抽滤，洗涤多次 4℃水浴中搅拌反应 抽滤，洗涤多次 测定固定化漆酶活力，选择最佳方法，优化固定化条件 D380树脂的预处理 方法一 方法二 4℃水浴中搅拌反应 25℃，恒温振荡吸附 戊二醛溶液 缓冲液和 酶液 图2．1两种固定化方法的流程图 2．1．2．3漆酶活性的测定 根据实验条件，本文以邻联甲苯胺做底物，采用紫外分光光度法测定该真菌漆酶的酶活力。自由漆酶活力的测定方法【7 2】：按照表2．3所示，加入各试剂于比色管中，在25℃的恒温水浴中保温30min，以煮沸灭活的方式终止反应，在VIS-7220G型紫外一可见分光光度计上按表1所示波长测定吸光度值。定义每分钟引起0．0 l吸光度值变化所需的酶量为一个酶活力单位(U/mg)。同时做3个平行样，一个空白样(0．1 ml酶液换为蒸馏水)，结果计算取平均值。 表2．3．漆酶活力测定 底物缓冲液漆酶用量测定波长0.5ml 3.36mM 邻联甲苯胺3.4ml 0.1M,pH 4.6 醋酸-醋酸钠溶液0.1ml 0.1mg/ml 漆酶溶液600nm 固定化酶活的测定：称取50mg固定化漆酶于比色管中，加入表2．3中的底物和缓冲液，在气浴恒温振荡器中25℃下振荡30mi n，取上清液测其在600nm处的吸光度值，计算每克载体的酶活(u/g)。同样做3个平行样，一个空白样，结果取平均值。 固定化漆酶的酶活活回收率按照下式计算： 酶活回收率（%）=固定化漆酶的总酶活/所用自由漆酶的总酶活 2．1．2．4漆酶的米氏常数Km的测定 按照测定自由酶和固定化酶的方法，配制不同浓度的底物，反应后测定