第二章菌種与种子扩大培养.pptVIP

第二章 菌种与种子扩大培养;本章讲述内容;第一节 微生物工业用菌种;2、分离思路 ;定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。; （1）采样;采取土壤样品要考虑的几个问题;（2）增殖培养;（3）培养分离;稀释分离法; 划线分离法——平板划线法;（4）筛 选;;2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。;Ⅱ、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。;（5）菌种鉴定;（6）毒性试验;二、菌种的保藏与复壮;; 菌种保藏的方法很多，一般有下面几种： A 斜面冰箱保藏法（酵母） 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。 B 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。;C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ） 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是： 首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l－2∶l混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用30－100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期可达2-10年不等。 ;D真空冷冻干燥保减法（细菌，防线菌 ） ;E 液氮超低温保藏法（细菌，真菌） 液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保臧法。其保存期最长。 a 原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一130℃），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。 ;b 操作方法及步骤 （1）安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用95料或GCl7的玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。 （2）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10％甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.2－1mL。 ;（3）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。 美国 ATCC采用先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。 （4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或35－40℃水浴中迅速解冻，当升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。 ;4、国内外主要菌种保藏机构介绍 菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为重视，设置了各种专业性保臧机构，主要的菌种保臧机构介绍如下： （1） ATCC American Type Culture Collection. Rockvil1．Maryland.U.S.A。 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。 （2） CSH〔 （Cold Spring Harbor Laboratory），U.S.A 冷泉港研究室，美国。;（3） IAM （Institute of Applied Microbiology），University of Tokyo，Japan。 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。 （4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka，Japan。 发酵研究所，日本大阪。 （5） KCC （