3 第三讲1 分子克隆载体.ppt

;目的基因;基因操作的基本步骤;载 体;;;;;; ;;;;质粒的基本性质：1 复制;;;3 质粒的转移性;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒克隆载体的基本策略;;质粒的命名;; pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。 含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。 将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101中含tetr基因的DNA片段同含ColE1复制起始点(来源于pMB1、松散型)的DNA片段重组，构建成质粒克隆载体pBR322。;;普通型载体pBR322的结构图;pBR322 ;;;;pUC的主要优点： （1）分子量更小，仅为2686bp，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 ;pUC18; Blue White;; 把感染细菌的病毒称为噬菌体。 病毒主要有DNA（或RNA）和外壳蛋白组成。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞。;;λ噬菌体的性质 ;; 溶源途径：感染宿主细胞后，其DNA与宿主细胞染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力。（右图示）;裂解循环;λ噬菌体的基因组分区;λ噬菌体的基因组分区;λ噬菌体的基因组分区;用λ噬菌体作为克隆载体的依据; λDNA的限制性核酸内切酶谱（Kb）; λ噬菌体载体的构建过程;;λ噬菌体的主要类型;插入型载体; 主要用于cDNA克隆，允许插入的外源DNA片段大小为0～6kb。基因cI内的E.coRI 位点作为唯一位点，可以用于外源DNA的插入。; 主要用于cDNA文库、基因组文库和表达融合蛋白。允许插入的外源DNA片段的大小为0～7.2kb。基因lac5编码区终止密码子之前有一个E.coRI，可以用于外源DNA的插入。;置换型载体; M13噬菌体载体;; 黏粒载体(cosmid vector);黏粒载体的特点： （1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周??，无法形成子代噬菌体颗粒）； （2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达40kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA文库的构建。;;部分柯斯质粒的基本特性;人工染色体载体(artificial chromosome vector); ;;赭石突变抑制基因sup4;;(bacterial artificial chromosome, BAC); 思考题：