实时荧光PCR原理.pdfVIP

节? ? 图 3-2 实时荧光 PCR 原理 一 基因诊断与核算扩增 前已提及，基因诊断的应用范围日趋广泛，传染病可以通过检测致病微生物的基 因进行诊断，遗传病可通过检测病人自身的基因进行诊断。人类基因组学的成果正把 越来越多的疾病与特定的基因联系起来，包括肿瘤、心血管疾病、糖尿病等。对于一 个看似简单的问题——有哪些疾病跟基因无关，人类遗传学家恐怕一时也难以回答。 基因诊断技术虽然为数众多，但可以划分为扩增和非扩增两大类。扩增类就是在 诊断过程中，涉及到待测基因的复制过程。非扩增类则无该复制步骤。由于待测的致 病基因或其片段只是整个原因组的一小部分，而且常常含量稀少，所以多数情况下， 都需要扩增步骤。实际上，正是各种扩增技术的出现，才成就了现代意义基因诊断的 兴起。相对的，非扩增技术，如测序，荧光原位杂交等仅仅用语一些特殊的场合。值 得一提的是一种通过放大“标记信号”而不进行靶基因扩增的测定方式——分枝 DNA 探针（brached DNA）技术可获得了相当于扩增技术的灵敏度。美国 Chiron 公司在此 平台上，推出了乙型肝炎、丙型肝炎和 HIV-1 的诊断试剂盒。在各类扩增技术中，以 PCR 的地位最为突出。关于 PCR 以及相关的基因扩增技术，前面的章节以说明，本 章不再赘述。本章将重点介绍近年来新兴的实时荧光 PCR 检测技术。 实际上，PCR 自诞生之日起，就一直未离开过荧光检测。每个有分子生物学经验 的人，都知道在 PCR 产物完成电泳后，会用一种“有毒的”EB（溴化乙锭）来染色， 然后在紫外灯下观察那些发红的 DNA 条带，这是一个典型的荧光检测实验。因为 EB 在与 DNA 结合后，在紫外光激发下会发出红色荧光，我们就用肉眼来检测这些荧光， 借以判断产物的位置，有经验的人能常常一眼看出 PCR 的结果，几年前，国内的分子 诊断实验室也是这样来“看”病的。 二 PCR 产物的检测方法 利用 PCR 进行诊断，必须考虑 PCR 产物的检测，以确定被测基因的有无与多少。 从早期的琼脂糖电泳到现在的实时荧光 PCR，各类检测技术名目繁多，但概括起来可 以分为固相检测和液相检测两种。固相检测的概念与免疫分析中的一样，常常借助于 一个“固相”的载体或介质，把检测的基因“分离”出来，然后再进行缉拿册。在这 里，扩增产物的分离和检测是两个步骤。所以该法又有“分离式的”、“异相的”等称 呼。传统的凝胶电泳就是一个典型的固定相检测方法。液相检测则无须一个固相介质， 它是在未经过任何分离步骤的前提下，直接显示被检测基因的存在与多少。实时荧光 PCR就是液相检测的典型例子。图3-2给出了用于荧光PCR产物检测的各种固相相法。 值得提出的是，由于液相检测技术教晚，目前通过 FDA（美国药物食品管理局） 获准上市的 PCR 诊断试剂盒都是采用固相检测，如 Roche 公司著名的 PCR-ELISA 系 列测试盒。另外，倍受重视的 DNA 芯片技术以及“芯片上的实验室“目前也是建立 在固相检测技术基础上的。前者是直接采用故乡杂交技术，优势是高通量。后者则是 液流驱动电泳分离式的，特点则是自动化程度高。从样品制备、核算扩增、电泳分离 检测，自动按程序完成。虽然新片技术普遍采用固相检测原理，但并不能认为这种结 合是逻辑上的必然，因为芯片技术进入基因检测时，均相检测技术尚未兴起。实际上， 将均相检测的概念引入芯片技术又可能大大改观现有芯片的面貌。目前已经引起研究 者的关注。 三 实时荧光 PCR 的原理 ( ? ) 实时荧光 PCR 的概念 人们对临床诊断技术的要求，就是要更特异、更灵敏、更快速、更简便、更便宜、更加 自动化。这些要求成为分子诊断检测技术发展的强大驱动力。近年来，分子诊断的一个突破 性进展就是集扩增、检测和靶定量与一体的实时 PCR 的出现。 所谓实时荧光 PCR，就是利用荧光信号检测整个 PCR 扩增过程，获得在线描述 PCR 过 程动力学曲线。实时荧光 PCR 带来的好处是熟悉传统方法的人所无法想象的。首先，传统 的 PCR 检测方法属于终点测定方式，在测定 PCR 扩增产物前需打开反应管，容易造成产物 污染，成为“假阳性“的主要来源。实时 PCR 在扩增过程中动态检测，完全以闭管方式进 行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染源。其次，传统 PCR 都是在 PCR 到达平台期后进行 检测。PCR 经过指数期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现 性很差。实时 PCR 方法则利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测， 此时样品间的细小误差尚未放大，因此该 Ct 值具有记号的重复性。通过对每个样品的 Ct 计算，对初始模板浓度作图就可以获得准确的工作曲线，线性范围可达