基因工程试验指导.pdfVIP

《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年 5月 基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本 原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这 些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的 讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的 训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有 外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因 的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物 学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研 究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域必威体育精装版重大 进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因 动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。 同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实 的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与 检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体 外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料 3.1 酶类 限制性内切酶：EcoR I、Sal I、Age I、Not I、BamH I；T4 DNA聚合 酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连 TaKaRa公司产品； 3. 2 菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至 EGFP的 N端的哺乳 动物表达载体，为 Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图 1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的 pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和 SV40复制起始点（真 核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核） 的抗性基因，见图 1。异源性蛋白与 EGFP阅读框一致地克隆入 pEGFP-N1， 形成的表达重组体在 CMV 启动子启动下，表达 EGFP 和目标蛋白的融合 蛋白。该融合蛋白保持了 EGFP 的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内 定位。 3. 3.2 pMD18-T载体 pMD18-T载体是线状 DNA，2.7kb，3’端有 oligo(dT)，可插入 PCR扩 增产物。插入位点两侧有常用的限制性内切酶酶切位点和 T7、SP6 RNA聚 合酶转录起始位点。带有氨苄青霉素抗性基因，见图 2。 图 2 含有氨苄青霉素抗性的 pMD18-T载体 3. 4 试剂盒 质粒小量抽提试剂盒购自安比奥生物技术公司； 琼脂糖凝胶 DNA回收纯化试剂盒购自北京 TIANGEN公司； 无内毒素质粒大量抽提试剂盒购自北京 TIANGEN公司； DNA Ligation Kit Ver.2购自大连 TaKaRa生物公司。 3. 5 其他试剂 琼脂糖粉（Agar A）购自上海 Yito公司；氯化钠、异丙醇和丙三醇购 自长沙分路口塑料化工厂；无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂；胰蛋白 胨（Trytone）、酵母提取物（Yeast Extract）、琼脂糖（Agar M）购自加拿大 BBI公司；EB染液购自深圳市达科生物技术有限公司。 3. 6 DNA分子量Marker DNA ladder mix #SM0331（深圳晶美公司） DNA ladder 100 bp #SM0321（深圳晶美公司） DNA ladder 100 bp #SM0241（深圳晶美公司） 3.7 PCR引物 CMLC2 启动子上游引物（CMLC2-L），下游引物（CMLC2-R）序列 如下： CMLC2-L：5’-GAATTCAATGAGCTCTCCAAATCAGCAG-3’ (划线部 分为 EcoR I酶切位点) CMLC2-R：5’-GGATCCGAGGAAACCGATTGCTACAAACC-3’ (划线 部分为 BamH I酶切位点) 3.8主要仪器 PCR仪，低温高速台式离心机，fresco离心机，SHINADZU电子天平，超 净工作台，ZF-90 型暗箱式紫外透射仪，DYY-III 8B 型稳压稳流电泳仪， 微波炉，XK96-A 快速混匀器，GBII240-89 不锈