热酸酚法从酵母中提取TotalRNA标准操作规程.docVIP

热酸酚法从酵母中提取Total RNA 标准操作规程 1 目的 本标准操作规程用于规范热酸酚法从酵母中提取Total RNA的操作。 2 范围 本标准操作规程适用于热酸酚法从酵母中提取Total RNA的全过程。 3 职 责 3.1 项目负责人： 3.1.1 负责监督执行，并对该SOP中技术参数的准确性、操作规范的正确性负责。 3.2 项目组实验人员： 3.2.1 在整个实验过程中严格执行本操作规程。 4 程 序 4.1 材料准备 实验所需的试剂、仪器设备和耗材分别见表1、表2、表3。表 1 试剂 试剂 目录号 规格 生产厂家 贮存条件 TES溶液 / 100 mL CapitalBio RT 水饱和酚 ALBPH-008 250 mL 奥莱博 4℃ 氯仿 / 500 mL 益利精细 RT 3M NaAc pH5.2 / 50 mL CapitalBio -20℃ 无水乙醇 / 500 mL 益利精细 RT 表 2 仪器设备 仪器 型号 生产厂家 特殊要求 超净工作台 CJT-16 北京长城 N/A 冷冻离心机 5810R Eppendorf N/A 水浴锅 HH SY11-NI 北京长风 N/A 涡旋混合器 TDX-1 TonDa N/A 微量台式离心机 5415D Eppendorf N/A 冰箱 BCD-223N 美菱 N/A 移液器 P-2,P-20,P-200,P-1000 Eppendorf N/A 离心管架 0.2 mL, 0.5-1.5 mL 江苏三和金冠 N/A 紫外分光光度计 ND-1000 NanoDrop N/A 浓缩仪 5301 Eppendorf N/A PCR仪 PTC-225 MJ N/A 凝胶成像仪 CBC/UVP I-D001 CapitalBio N/A 表 3 耗材 耗材 规格 生产厂家 特殊要求 一次性吸头 0.5-10 (L, 2-200 (L,100-1000 (L Axygen RNase-free 一次性薄壁离心管 0.2 mL, 1.5 mL Axygen RNase-free 一次性离心管 50 mL Corning RNase-free 4.2 实验前准备工作 4.2.1 打开超净台的紫外灯，灭菌15 min，然后通风10 min。 4.2.2 配制TES溶液： 在80 mL DEPC水中加入1 mL 1 M Tris-HCl （pH7.5），2 mL 0.5 M EDTA，5 mL 10% SDS，定容至100 mL，高压灭菌。 4.3 操作步骤从8℃冰箱中取出有菌体沉淀的1.5 mL离心管室温，先后加入400 (L TES液、400 (L水饱和酚，剧烈振荡混匀，于60-65℃的水浴中加热1 h，期间每隔约10 min剧烈振荡一次。 冰浴5 min，在4℃12,000rpm离心 min。 水相转移至一新的1.5 mL离心管中， 400 (L水饱和酚抽提一次，4℃12,000rpm离心 min。 水相再转移至一新1.5 mL离心管中，氯仿抽提一次，4℃12,000rpm离心 min。 水相再转移至一新1.5 mL离心管中（约400 (L），加入1/10体积的DEPC水配制的NaAc（3 M，pH5.2）及2.5倍体积的无水乙醇，-20℃ 静置30 min，4℃12,000rpm离心10 min。 弃上清。加入1 mL 75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，颠倒几次，4℃7500 rpm 离心5 min。 弃去75％乙醇超净台中自然干燥15-30 min，不要真空离心干燥， RNA不要完全干透，以防不能完全溶解，用RNase-free water溶解RNA，60-65℃助溶5-10 min。 进行Total RNA定量，如果不马上定量，将样品贮存于-80℃。操作参见《分光光度计标准操作规程》-80℃。 琼脂糖甲醛变性胶凝胶电泳检测Total RNA完整性。操作参见《琼脂糖甲醛变性胶凝胶电泳标准操作规程》 5 注意事项 5.1 步骤酵母菌OD600一般不要超过1.5，否则细胞的基因表达谱会受到营养条件的限制而发生改变。 5.2 在4.3.步骤中， 6 引用文件 《分光光度计标准操作规程》 《琼脂糖甲醛变性胶凝胶电泳标准操作规程》 博奥生物有限公司生物检测实验室 文件控制编号：AG-SPRL-01-00-2007 第 1 版 第 0次修订 第 1 页 共3 页 作业指导书：热酸酚法从中提取Total RNA 标准操作规程 博奥生物有限公司生物检测实验室 文件控制编号：AG-SPRL-01-00-2008 第 1 版 第 0次修订 第 1 页 共3 页 作业指导书：热