EDU细胞增殖检测.docVIP

荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例) 细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理 (可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。 EdU标记 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50μM EdU培养基； 注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(2h)宜采用高浓度(10~50 μM)，长时间孵育(24h)宜采用低浓度(1~10μM)； 2)如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。 表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考 96孔板* 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5 cm 小皿 EdU培养基 100 μl 150 μl 200 μl 300 μl 500 μl 2 mL 染色反应液 100 μl 150 μl 200 μl 300 μl 500 μl 2 mL    注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜； 2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。 1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基； 注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间； 2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表1)； 1.3 PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。 注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。 表2 EdU孵育时间设定参考 3T3 Hela HEK293* 细胞系 人胚胎细胞 酵母细胞 人成纤维细胞 人宫颈癌细胞 人胚肾细胞系 人神经细胞 细胞周期 ~30min ~3h ~18h ~21h ～25h ~5d 孵育时间 5min 20min 2h 2h 2h 1d     注： 1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多； 2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。 表3 细胞实验EdU孵育浓度及时间参考 PubMed ID Reference Cell line Concentration Time Salic A, et al. PNAS. 2008 NIH3T3, Hela 10 nM~10 μM 1 hr Cappella P,et al. Cytometry A. 2008 HL-60, A2780, U2OS 1~10 μM 30 min Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods. 2009 Neurospheres 1~20 μM 24 hr Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009 Primary fibroblasts 10 μM 1,2,4 hr Warren M, et al. Dev Dyn. 2009 Chick embryos 10 μM~2 mM 4 hr Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009 Spleen cells 50 μM 24 hr Momcilovi? O, et al. Stem Cells. 2009 Human ES cells 10 μM 30 min Cinquin O, et al. PNAS. 2010 emb-30 1 μM 12 hr Han W, et al. Life Sci. 2009 VSMC 50 μM 2 hr Huang C, et al. J Genet Genomics. 2010 ESC 50 μM 2 hr Hua H, et al. Nucleic Acids Res. 2011 fission yeast strains 10 μM 3 hr Lv L, et al. Mol Cell Biochem. 2011 EJ cells 50 μM 4hr