大肠杆菌生理生化鉴定实验步骤.doc

大肠杆菌生理生化鉴定路线： 氧化酶 （-）→苯丙氨酸脱氨酶（-）→H2S（-）→DNA酶（-）→乳糖（+）→柠檬酸盐（-）→D-阿东醇（-）→赖氨酸脱羧酶（+）→纤维二糖（-） 1、氧化酶1、原理： 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 试剂 盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。 方法 在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。 4、注意事项： a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。 b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。 c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。 苯丙氨酸脱氨酶1、原理： 某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。 2、培养基 酵母膏 3g NaCl 5g Na2HPO4 1g DL-苯丙氨酸 2g (或L-苯丙氨酸) 1g 蒸馏水 1000 ml pH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。 3、试剂 10%(W/V)的FeCl3溶液 4、方法 适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。H2S(TSI) 变形杆菌 鸡白痢沙门氏 1、原理： 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 2、培养基： 牛肉膏 7.5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 明胶 100~120g(或琼脂15g) 10%FeCl2 (培养基灭菌后无菌加入) 5 ml 蒸馏水 1000 ml pH 7.0，112℃灭菌20min 在明胶培养基尚未凝固时，加入新制备的过滤灭菌的FeCl2，用无菌试管分装，培养基高度约为4~5 cm，立即置冷水冷却凝固。 3、方法 用穿刺法接种，30℃培养，1、3、7天，观察，变黑者为阳性，不变为阴性。 4、注意事项 ①此方法适用于肠杆菌科细菌鉴定 ②在实验过程中可用硫酸亚铁代替氯化亚铁 ③可同时测定明胶液化，20℃培养糖、醇发酵实验[乳糖] 1、培养基： 蛋白胨水（pH7.6） 100ml 需要的糖(醇)类 11.6%溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml） 制法： 1、将所需糖（醇、苷）1克，加入100ml蛋白胨水中，并按比例加入0.5%~0.7%琼脂制成半固体培养基，加热溶解。 2、加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml），摇匀。 3、分装于试管内， 10 磅高压灭菌20 分钟，检验备用。 附：蛋白胨水培养基： 蛋白胨 1 克 氯化钠 0.5 克 蒸馏水 100ml 1、将以上成份混合，加热溶解，校正pH 至7.4~7.6。 2、过滤、分装试管，每管约3ml。 2、方法： 以18—24h幼龄菌种作种子，穿刺接种，每株2支。同时还要有标准株和不按种管作对照。37℃培养1、3、5天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）则为阴性。 1、原理： 某些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳的唯一来源和无机磷酸铵作为氨的来源，因此能够在含有上述成分的合成培养基上生长，并且分解柠檬酸盐最后生成碳酸盐，使培养基变为碱性。