环境致癌物真核细胞DNA传感系统初步研究.pdfVIP

环境致癌物真核细胞DNA传感系统初步研究幸 石丹 张江华 江明 梅素容周宜开 吕斌 华中科技大学同济医学院环境与健康教育部重点实验室湖北武汉430030 摘要：【目的】利用含GADDl53启动子含光素酶(LuC)报道基因的重组人肝二倍体细胞株发光传感 系统检测环境致癌物．【方法】将含全长GADDl53启动子的质粒，瞬时转染人肝癌、HepG2细胞，构建 其发光值，比较不同种类(如重金属类、二英、苯并(a)芘、环境雌激素类等)和不同浓度环境致癌物对 且均显示了良好的剂量反应关系，同时致癌能力越强的物质，其萤光素酶的诱导率就越高．检测灵敏度 高于彗星实验和AMES实验．【结论】带有GADDl53一LUC质粒的重组人肝二倍体细胞株可用于快速、 敏感的检测某些类的环境致癌物． 关键词：HepG2细胞株重组GADDl53萤光素酶环境致癌物 DNA是生物体内的遗传物质，环境致癌物通过直接或间接作用造成的DNA损伤，能引起基因突变和细 虫萤光素酶作为报告基因，构建一株可以快速灵敏检测DNA损伤的真核细胞系，并评价其检测敏感度、遗 传毒性检出阈，为筛选环境致癌物提供一种新的方法。 1．材料与方法 1．1材料 2000转染试剂盒，OPTI．MEM pGADDl53--LUC由本实验室构建，；虫萤光素(Pierce公司)；Lipofectamine 剂均为国产分析纯。 1．2方法 (1)细胞转染与染毒 人肝母细胞瘤细胞株HepG2按转染试剂盒说明书进行转染。转染后的细胞，在新鲜不含胎牛血清的培 和湿度下继续培养24h(过氧化氢和顺铂培养时间为lh)后测量。 (2)发光检测 按荧光素酶测定试剂盒说明检测萤光素酶活性同时测定蛋白浓度。酶活性用RLU／Ixg蛋白表示。各剂量 组的发光值与正常对照组的发光值的比值表达萤光素酶的诱导率。 (3)单细胞凝胶电泳 40-95％重度损伤：D级：95％完全损伤。 (4)评价指标敏感度(％)=阳性结果的致癌物质／致癌物总数×100％遗传毒性检出阈(IS g／m1)．实验中检 ‘基金项目：国家自然科学基金资助项目fN 400 出阳性反应的最低剂量。 (5)统计学分析用SAS8．1分析软件对数据进行方差分析或者t检验，P0．05差异有统计学意义。 2．结果与讨论 2．1 GADDl53．LUC细胞与SCGE对化学致癌物质的检测 从表l可见，除二氯甲烷和环磷酰胺的萤光素酶的诱导率为阴性外，总共9类26种环境致癌物的阳性 验。在剂量反应关系方面，萤光素酶诱导率基本上随着反应剂量的增加而逐渐增强。而且致癌能力越强的物 质，其萤光素酶的诱导率就越高。 表1环境致癌物萤光素酶诱导率检测结果 致癌能力 反应剂量范围 萤光索酶 Ames 受试物 (IARC标准分类) (u 诱导率 实验1 g删) 金属类 氯化镉 t O．228—2．283 1．453—5．483 ● 重铬酸钾 l 0．294一1．764 1．393—2．195 + 氯化汞 l O．027—2．715 1．974—4．127 ● 硝酸铅 2A 1．ooo—100．000 1．346--2．498 ● 五氧化二钒 2B 5．OOO一100．ooO 1．326一1．904 +／-