第三代基因编辑技术CRISPRCas9规范.pptVIP

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2017-03-21 发布于湖北
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第三代基因编辑技术CRISPRCas9规范.ppt

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第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9 专题内容基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术, 可以精确地定位到基因组的某一位点, 并剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段基因编辑技术基因编辑工具锌指核酸内切酶（ZFN）类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）成簇、规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9（CRISPR/Cas9）基因编辑工具 ZFN TALEN CRISPR/Cas Target Protein: DNA Protein: DNA (gRNA-Cas9): DNA Structure Zinc finger DNAbinding motifs in aββα configuration,the α-helixrecognizes 3 bpsegments in DNA Proteins containingDNA-binding domainsthat recognize specificDNA sequences downto the base pair 20nt crRNA (CRISPR RNA) fused to a tracrRNA and Cas9 endonuclease that recognize specific sequences to the base pair Feasibility Difficult:-Need a customized protein for each gene sequence-Low delivery efficiency Easy:- all-in-one gRNA-Cas9 vector system- multi gene editing is feasible Reference Beerli et al., 1998Perez-Pinera et al.,2012Gaj et al., 2013 Moscou andBogdanove, 2009Boch et al., 2009Gaj et al., 2013 Mali et al., 2013Cong et al., 2013Jiang et al., 2015 1987 Ishino?Y等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列 2005 三个研究小组均发现 CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源 2002 该结构被正式定义为成簇、规律间隔短回文重复序列（CRISPR） 2007? Barrangou?等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抗噬菌体入侵。 2013? Zhang 研究组首次在人293T细胞与小鼠Nero2A细胞中利用Crispr/Cas9系统实现了基因定点突变。 Crispr/Cas9 研究历史 II型CRISPR免疫 II型CRISPR免疫 Crispr/Cas9系统核心：Cas9核酸酶、sgRNA CRISPR系统结构 (间隔相邻基序) Cas9切割后的DNA修复编辑效率检测 T7E1 Assays sgRNA设计功能物种数最大输入长度（nt）网址 CRISPR Design 设计/脱靶效应评估 15 23-500 ZiFiT 设计/脱靶效应评估 9 不限 /ZiFiT Cas9 Design 设计/脱靶效应评估 10 不限 Cas-OFFinder 脱靶效应评估 25 15-25 /cas-offinder E-CRISP 设计/脱靶效应评估 33 不限 /E-CRISP/index.html CRISPR-P 设计/脱靶效应评估 33 23-5000 /crispr CHOPCHOP 设计/脱靶效应评估 23 不限 /index.php GT-Scan 设计/脱靶效应评估 28 不限 .au/gt-scan/submit 基因编辑流程 T7E1 Crispr系统应用 GeneticDiseases Cancer CardiovascularDisease HIV Viral Diseases Immunodeficiency Crispr系统应用 Wenhui Hu, et al. PNAS.?2014,?111(31):11461-6 CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够有效利用其 sgRNAs 靶向作用于 HIV-1 原病毒 LTR(长末端重复序列) 区，对 HIV-1 原病毒进行有效清除。在感染