第五讲放射免疫分析技术2007课件.pptVIP

放射免疫分析技术 在廿世纪60年代初，Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法定量测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。从此放射免疫分析以其灵敏度高、特异性强、重复性好、准确度高等特点而被广泛应用于医药研究中。 随着放射性碘化标记技术的不断革新、分离技术的改进和亲和素-生物素系统放大技术应用于放射分析技术中，放射免疫分析法的分析精密度、特异性和灵敏度更为提高，操作流程更加简化方便。 1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。 由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术. 放射免疫分析基本原理 放射免疫分析的基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合 ,这种竞争可用以下反应式来表示： 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原-抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线，也称剂量效应曲线（calibration curve）。 放射免疫实验方法的建立 （一）、抗原纯化及标准品制备 1．抗原纯化的必要性：提供高纯度抗原是建立任何RIA法所必须的关键条件。 首先，用高纯度抗原制备RIA的标准品，使检测标准化并用它来监测生物样本的回收率 ； 第二，用高纯度抗原制备标记抗原，用作RIA的示踪剂 ； 第三，用高纯度抗原制备免疫原，以生产特异抗体。 在RIA系统中，最理想的是用作标准品的标记物的抗原，与待测的内源性抗原具有同一性，但两者间有时会出现种种差异。这些差异包括：（1）种族差异 ；（2）组织差异 ；（3）物质的多型性 。 由于抗原存在种种差异，在选用纯化抗原及评价RIA检测结果时，应予充分考虑。 2．抗原纯化的方法 RIA中抗原纯度至少要求达90%以上，在采用免疫电泳法鉴定时，应仅出现一条抗原体结合的沉淀线，或在聚丙烯酰胺凝胶电泳中只出现一条区带。抗原纯化的方法有以下3种 ： （1）理化方法 包括盐析法、有机溶剂抽提法、离子交换法、凝胶过滤法、各种电泳分离法以及各种层析分离法等。 （2）免疫方法 包括解离法、戊二醛固相吸附法及亲和层析法等，采用单克隆抗体的免疫吸附柱的纯化效果更为理想。 （3）理化法与免疫法相结合 此为最常用的方法，纯化效果亦较好，一般是先用理化法提纯抗原，然后再用免疫法进一步纯化。 3．标准品的制备 用作标准品的物质除应具有高纯度外，还须具有相当的稳定性，标准品的制备原则如下： （1）同批制备大数量的标准品 ：为避免不同实验室或不同时间制备的标准品出现变异，应同批制备供应许多实验室且至少够用一年以上的公共标准品 ； （2）在标准液中保持足够量的蛋白质 ：当其本身的蛋白质浓度不够时，可加入一定时的载体蛋白以提高抗原的稳定性，还可防止反应试管对微量蛋白的吸附，以提高检测的准确度 ； （3）制备一套不同梯度浓度的标准品时，采用“容积交换法”，即各个浓度的标准品，都应从一个总标准品来独立制备，以免除倍比稀释法所致的累积误差。 （二）、抗体的制备 RIA法的特性在很大程度上取决于抗体的特异性和亲和力，而抗体的特异性又主要取决于免疫原上的抗原决定簇 。 1．免疫原 免疫原与抗原的概念不同，抗原是指能和专一抗体相结合的物质；而免疫原是指那些能引起主动免疫反应的抗原，即注入动物体内能诱发产生抗体的物质。抗原必须具备下列性质才可用作免疫原： （1）分子量大 一般说，物质的免疫原性与其分子量直接相关，但免疫原性并不仅仅取决于分子量，还要求具有一定的复杂结构 ；（2）异己性强 ，抗原蛋白质的氨基酸排序与被免疫动物体内蛋白质结构差别越大，其免疫原性越强 ；（3）分子的立体构型，当抗原氨基酸排列相同时，由于立体构型能把抗原决定簇暴露在外，则免疫原性强 ；（4）溶解度小 在水中溶解度小的免疫原易诱发免疫反应 。 2．半抗原 ：本身不具备免疫原性，当它们以共价键结合到载体物质上才具有免疫原性 。如甾体激素、甲状腺激素及前列腺素等多种小分子物质 。通常使半抗原的羧基