第23章临床酶学检验的原理和方法学案.pptVIP

第二十三章  临床酶学检验的原理和方法 一、酶促反应进程 酶促反应动力学参数 1.初速度(initial velocity)指在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度，用v0来表示 2.最大反应速度(maximum velocity)指当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示 3.米氏常数（Michaelis constant，Km）指酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度 酶促反应 延滞期 lag phase 线性 linear phase 非线性期 non-linear phase 零级反应 一级反应 二、定时法 酶活性浓度测定方法 酶活性浓度：用反应速度反映酶浓度[E]，要求酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，此时两者之间存在线性关系。 按反应时间分类：定时法和连续监测法 按检测方法分类：量气法、分光光度法、荧光法、 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等。 （一）概念 主要优点 设备简单，操作方便，检测过程中无需恒温设备，用分光光度计即可测定，也不用考虑显色剂对酶活性的影响，是早期常用方法。 主要缺点 确定选定的反应时间是否处于线性期。 （三）计算 酶活性浓度的计算公式 摩尔吸光系数 ? 和系数 K 均为常数， ? 和 K受仪器诸多因素的影响， 如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。 ? 和 K 可用校准物定期校正。 2. 吸光系数 Absorptivity 3.2 校准物 可用作酶活性测定用的校准物分两类。 一类是产物的基准物质， 如对硝基酚、对硝基苯胺等， 用于校准仪器的 ? 值（摩尔吸光系数）。 另一类称酶校准物（Enzyme calibrator）， 多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近， 用于校准仪器的 K 值（酶活性浓度定量系数）。 3.2 校准物 国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。 各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。 常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。 目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。 3.3 ε的校准（340 nm波长） NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。 在340nm?的NAD(P)H的?，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的?。 NAD(P)H的ε为6220。 如果6 000ε6600为不合格，则需找维修部检查。 注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。 3.3 ε的校准（405 nm波长） 最常用的色素原为对硝基苯酚等。 对硝基苯酚在405 nm的?，可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算ε值。 对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大，则需找维修部检查。 3.4 K的校准（酶校准物） 使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。 使用酶校准物的优点， 除具有实测ε值换算出的校准K值所具有的一切优点外， 还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。 3.4 K的校准（频率） 最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。 仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。 但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准： 试剂盒改变厂家，或者更换了批号； 仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件； 质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。 主要优点 勿须终止酶促反应，不需添加其他显色试剂，就可直接测定反应物的变化，可以明确找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定。 主要缺点 在特定条件下进行，要求精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。 一、酶活性测定最适条件 二、酶活性测定的影响因素 主要包括： 1.底物种类和底物浓度 2.缓冲液种类和离子强度；反应液的最适pH 3.反应温度 4.辅因子、激活剂浓度，指示酶和辅助酶的用量 5.测定时间，延滞期应尽量短暂并有足够的线性期 6.样品与反应试剂的比例，检测范围 定时法 无机P 酚 氨 萘胺 NAD(P)H H2O2 丙酮酸 淀粉 ALT、AST、LD ALP、ACP、5’NT ALP、ACP ADA、脲酶 CK、GGT LD、GLD、G6PD ALT AMS （四