双向电泳技术和实验流程研究报告.pptVIP

* 4、固相pH梯度的优点和注意事项 3、固相pH梯度等电聚焦原理 蛋白质分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中迁移，知道达到自己的等电点，停止迁移。 固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的第一相，但固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH测定困难，只能计算。 注意事项：温度：20-30℃ ；电压：梯度上升。 * 加样方式 * 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH * 第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。可得到天然蛋白质的分子量。 * 连续电泳 不连续电泳 浓缩效应 凝胶层 缓冲液离子成分 pH 电位梯度 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 * 2、影响凝胶聚合的因素 形成凝胶试剂的纯度 凝胶浓度 温度和氧气的影响：23-25℃ 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 * 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。 分离测定： 测分子量(与标准蛋白比较) 鉴定样品纯度(条带数目) 测定样品蛋白含量：扫描定量(比色) * 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类 3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的影响因素 溶液中SDS单体的浓度 二硫键是否完全还原 缓冲系统的选择 凝胶浓度的选择 * 凝胶电泳的操作要点 1.凝胶制备 2.电极缓冲液 3.样品处理及加样 4.电泳 5.染色与固定 6.脱色 7.分析 * ？ pH值不对 = * 第四节 双向电泳 一、基本原理 IEF-SDS* 非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 变性2D：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后进行SDS。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式 双向电泳的分类 * 二、流程 （一）样品制备 （二）第一向：等电聚焦 1、加样 2、运行 （三）胶条的平衡 （四）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （五）胶上蛋白的检测 1、考马斯亮蓝染色 2、银染 3、负染 4、荧光染色 * （六）双向电泳凝胶的检测 1、目测 2、自动化检测 3、双向电泳的数据库 （七）双向凝胶电泳技术当前面临的挑战： 1、低拷贝蛋白的检测受限； 2、极酸或极碱蛋白的分离较难； 3、分子质量极大或极小蛋白的分离较难； 4、难溶蛋白的检测较困难； 5、得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术 * 一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真