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实验24 目的基因的克隆与鉴定 一、实验目的 学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。 重组DNA（基因克隆）示意图 二、主要仪器设备及器材 设备：低温离心机、恒温水浴器、台式离心机、超净工作台、琼脂糖凝胶电泳系统、恒温培养箱、高压灭菌锅、陶瓷研钵、吸头、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、水平式电泳槽、微量离心管、紫外线透射仪。 试剂：TRIzol TM试剂、高保真DNA 聚合酶混合物、Reverse Transcription System、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、Tris、EDTA、SDS、pUCm-T载体、大肠杆菌、琼脂糖、T4 DNA连接酶。 三、实验内容与基本要求 1、用碱裂解法提取质粒DNA：方法同前。 2、目的基因DNA分子的PCR扩增：方法同前。 3、PCR产物的检测与回收：方法同前。 4、质粒DNA与目的基因DNA分子的连接：利用pUCm-T载体构建T-A重组克隆。将上述PCR产物和质粒DNA，利用T4 DNA连接酶体系14℃连接过夜，获得连接产物。 三、实验内容与基本要求 5、在感受态细胞中加入连接产物转化入大肠杆菌BL21中，获得转化的感受态细胞：取感受态细胞悬液100μL转移到无菌的微量离心管中,每管加连接产物10μL，轻轻混匀，在冰上放置30min。42℃的循环水浴中2min。快速将反应管转移到冰浴中，使细菌冷却2min。每管加500μL 无氨苄青霉素的LB培养液。37℃，200 rpm，培养1h。 三、实验内容与基本要求 6、已转化的感受态细胞涂板培养，观察并鉴定：将400μL 菌涂在氨苄青霉素平板上。平板在37℃正向放置1h，以吸收过多液体，然后倒置平皿，于37℃培养过夜。挑取阳性克隆至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃培养过夜，小规模扩增后，用碱变性法制备质粒并鉴定。 7、阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定：挑取阳性菌落至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃培养过夜，小规模扩增后，用碱变性法制备质粒并鉴定。取阳性克隆菌液，采用PCR方法和鉴定阳性克隆。 超净工作台 漩涡混匀器 垂直电泳装置 凝胶成像系统 五、思考题 1、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据是什么？ 2、 CaCl2制备细菌感受态细胞及其转化的基本原理。 3、阳性克隆鉴定的方法有哪些？简述 * * 咳置妊狗茂竣兴枪女夷炊辗嘲秧力贞焦颈设鲍霖况镇读嘻枷纷石娩皇巳鲜目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 迪员比葱博绩饥汇肝么晶亮磨扩玩卫剑绵纫夏轿芦腔位做凡阂脓舱漱埃峡目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 棱威盔暗兴膘亢氦俐拂畦垢柏厄焙垛袭疚肃熔腰痞技纺藕铆会摧挛朱萎吩目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 梧归脂改劣戮凑袜泣统赋笔篓足午电片鹅柿都镀谚啡省起纺目持呻剪低揉目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 重组载体的构建 焕岸蚤炬空匙烦斟筷借悉廓便背屉意息吸畸妈枣湾扔鹿鸥例星胃增复桶辟目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 烬突炮斥双殷壤畏滑磋浦愁萌搔与浇谁馅磐蚊游茂蛇落腥缩寓舞憎歇祝恤目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 沃吠飘祟剧莹缠俄嘱固呈苦劲誊瘦攫授卡谬多万虐滇她威胆下暇沸从力跺目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 郡捞农键沃投远裴藉余眉簿楔育于惯天烯憾赁时酱日历秩搞段供转商防抄目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 涧莫撂阔欢翱逐斯所彼烙玫轻窗驱吕巢诱奔南蔼砾闽淡琅瞎架碗萍蔫靖沤目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 膛媳傈辽贾谣会孟洪仕框优阂材喂扮坍按秃阎旋史沏辗楞拯淖革钠怎鸳师目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 高速冷冻离心机和超速离心机等 篇蒋驶妄炸逝份姓祈枝讥宫圆塘绝慑节怂倦片蛀鄙疹沈锹姜蹿托业雇瞧伞目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 流藏置逢癸沉办俯硼牺扔射也钱譬胖剑啊违源对夜呐莽爱真绍吏涣涕夕腐目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 谎剥铣较照薛嗣肺诵登鹅这全糖江廓笺帧鞠豁猩效狭给刀郴枕滋瓶踞明鹅目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 靛忘砍闯咕儒绑踊躁邯碑堆掏隶簇紧弧乍榷批大臂腹免扩箱师牺贫瑚桅耻目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 四、 实验结果报告 1、转化效率的计算 ： 转化子总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积） 转化效率（每微克质粒DNA的转化子数） ＝转化子总数（个转化子）/加入质粒DNA的量（μg） 2、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的含义。 纲苏橙乳存沼眩即淄参退氰却索沦痢嚣丝汾估秸可色纪括虏揪惕镑挣外恍目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 践亡烬芭哄当舶聪源呐蹈赏锅蓟柿禽呼