厚壳贻贝Wnt4基因时空表达式.docVIP

厚壳贻贝Wnt4基因时空表达式 　　Wnt基因家族是一类通过编码分泌性糖蛋白信号分子，调节并控制生物体细胞存活、增殖和分化等过程，在生物早期发育和器官形成中起着非常重要的作用。在线虫、环节动物、节肢动物、棘皮动物和脊椎动物体内都发现Wnt蛋白。在人类中，Wnt信号通路被阻断导致发育紊乱。Wnt3a在小鼠体内调控着增殖刺激以及决定造血干细胞的命运。Wnt-2在果蝇体内通过引导色素细胞和肌肉前体细胞的迁移进而控制着雄性生殖特性。 　　Wnt4是Wnt家族成员之一，该基因已在人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、海胆(Heliocidaris erythrogramma)、果蝇(Drosophilamelanogaster)、沙蚕(Platynereis dumerilii)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、长牡蛎(Crassostreagigas)和日本血吸虫(Schistosoma japonicum)等中均有相关基因表达和功能的研究。在人类中，Wnt4是一个性别决定基因，与DAX1协同调控女性发育并阻止睾丸的形成。Wnt4在果蝇中不但参与调控视网膜轴突的正确导向，而且通过调节黏着斑促使细胞运动进而参与卵巢形态发生。Wnt4 mRNA首先表达在斑马鱼体节期的脑部，对细胞的运动具有抑制作用。在许多无脊椎动物和脊索动物中，Wnt信号通路参与调控个体生长发育，如刺胞动物(Hydra vulgaris)体轴形成、多毛类(Hydroides elegans和Capitella sp.I)体型分节、海鞘(Halocynthia roretzi)脊索细胞的形态发生运动及苔藓虫(Bugula neritina)变态过程。 　　在贝类中，Wnt4基因在栉孔扇贝成体的各个组织(雌雄性腺、外套膜、闭壳肌、鳃和肝胰腺)中均有表达， 而在成熟的性腺中表达量最高，并认为Wnt4基因对性腺生殖细胞的成熟具有重要作用。Wnt4基因在长牡蛎各种组织中(雌雄性腺、消化腺、鳃、外套膜和唇瓣)均有表达，且Wnt4基因在胚胎发育的桑葚期表达量最高，推测Wnt4基因可能参与了某些器官的形成。近期有研究发现Wnt基因参与了合浦珠母贝(Pinctadafucata)贝壳再生修复。 　　厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是我国重要的海产贝类，也是主要的贻贝养殖品种。以往的研究主要通过药理学、分子微生物学和神经发育生物学等角度阐述厚壳贻贝附着变态机制，对于Wnt信号通路是否调控双壳贝类附着变态过程仍是未知。本研究通过RACE技术克隆了厚壳贻贝的Wnt4基因全长cDNA序列，利用qRTPCR技术分析该基因在成体不同组织和幼虫不同发育阶段的表达特点。旨在为探究Wnt4基因是否参与幼虫生长发育和附着变态过程，以及在厚壳贻贝个体生长发育过程中的作用，为贝类相关的Wnt家族基因的功能研究提供一定的理论基础和数据支撑。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　厚壳贻贝亲贝来自浙江省舟山市枸杞岛，解剖获取外套膜、闭壳肌、鳃、足、消化腺、雌性和雄性性腺共7个组织样品。本实验根据Yang等所述方法进行人工受精和幼虫培育。用海水清洗亲贝，置于冰中过夜后，将亲贝放入10 L过滤海水(FSW)中，保持水温为18 deg;C。当亲贝个体开始产卵时，将其单独转移到含2 L FSW的玻璃烧杯中。用移液管将精子和卵子转移到一个含2 L F S W烧杯中， 混匀受精。受精卵放于18 deg;C培养，每个2 L烧杯幼虫密度为5个/mL。收集厚壳贻贝担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、眼点幼虫和稚贝5个发育阶段的样品。样品置于RNAlater中4 deg;C保存，24 h后弃RNAlater，ndash;80 deg;C冰箱保存以便用于RNA的提取。 　　1.2 RNA提取和cDNA合成 　　采用Molluse RNA kit试剂盒(OMEGA，美国)提取厚壳贻贝鳃组织总RNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，美国)检测所提取的RNA浓度，并用1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性。用SMARTerTM RACE cDNA AmplificationKit (Clontech，日本)按照操作指南合成RACE cDNA第一条链。 　　1.3 Wnt4基因克隆 　　根据厚壳贻贝转录组文库的注释信息，利用Primer Premier 5.0软件设计引物Wnt4-F1、Wnt4-R1(表1)扩增目的片段，25 mu;L体系为：10 times;PCRBuffer 2.5 mu;L，dNTP Mixture(各