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剖析HSV- 2 miＲ- H4 -5p 负调节CDKL2 基因的表达 　　单纯疱疹病毒Ⅱ型( HSV-2) 属疱疹病毒科alpha; 亚科，多引起生殖疱疹. 原发感染后，HSV-2 在骶尾神经节内长期潜伏，可在多种非特异条件刺激下被激活而复发. 疱疹病毒编码的microRNA( miRNA)被发现之前，潜伏相关转录体( latency-associatedtranscript，LAT) 是疱疹病毒潜伏感染期间唯一可检测的大量表达的基因，与病毒潜伏感染的建立密切相关，对其编码的microRNA 的功能研究逐渐受到国内外重视. LAT 基因编码的多种microRNA 可靶向调节病毒立即早期蛋白( immediate early gene， IE)表达，在转录后水平调节以促进病毒潜伏感染的建立，如: LAT 基因编码的miR-H1，miR-H6 可分别靶向ICP0 和ICP4. ICP0 和ICP4 的正常表达是病毒复制性增值的首要条件. 同时，LAT 基因编码的miR-H3 和miR-H4 可通过与ICP34. 5 mRNA 3#39;UTR反义互补，抑制其表达，以降低病毒对细胞的毒力作用. 而目前LAT 基因编码的microRNA 是否作于宿主细胞的相关报道较少. miR-H4 有miR-H4-5p、miR-H4-3p 两种亚型. 本研究结合课题组先前研究，结合生物信息学预测和双萤光素酶检测等实验，探究miRNA-H4-5p 在体外对宿主细胞功能的影响，为揭示HSV-2 潜伏感染的机制研究提供新的思路. 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 　　Vero 细胞、pmR-mcherry 质粒均为广州军区广州总医院医学实验科保存; psi-CHECK2 报告基因载体、Dual-Luciferase Reporter Assay System、GloMax 生物发光检测仪购于美国Promega 公司; 质粒提取试剂盒购于天根公司; LipofectamineTM LTX、TRIzol、SYBR Green PCR Master Mix、RPMI-1640 培养液和胎牛血清均购于美国Invitrogen 公司; 病毒基因组提取试剂盒为上海生工生物工程有限公司产品; 抗体购自英国Abcam 公司; 定量PCR 仪为ABIPRISM7500 Sequence Detection System; 细胞凋亡检测试剂盒Guava Nexin reagent 和流式细胞仪为Millipore 公司产品. 　　1. 2 miR-H4-5p 靶点预测 　　通过RNAhybrid( http: / / bibiserv. techfak. unibielefeld.de /rnahybrid /) 和Targetscan11. 0 软件，共同预测miR-H4-5p 猴基因组中潜在结合位点，结合课题组先前研究成果: RL1 片段编码的microRNA 可能具有抗细胞凋亡作用. 选择与细胞周期和凋亡相关基因，并结合两软件共同预测的交集: CDKL2、CNNM1( cyclin M1) 、CCNYL1( cyclin Y-like 1) 为研究对象. 经过qPCR 和Western 印迹实验发现，CNNM1 和CCNYL1 在mRNA 和蛋白水平上没有明显变化. 选择CDKL2 为候选靶基因. 　　1. 3 病毒基因组 　　提取HSV-2 感染Vero 细胞后，待60% ～ 70%细胞发生病变时收集细胞，反复冻融3 次，使细胞充分裂解释放病毒颗粒，离心后收集上清液，病毒基因组提取依照病毒基因组提取试剂盒操作说明进行. 　　1. 4 萤光素酶报告载体及突变载体的构建 　　通过miRbase 获得miR-H4-5p 前体序列. 并通过GenBank 获得CDKL2 3#39;-UTR 的全长序列，miRH4-5p 前体序列PCR 扩增茎环引物: 上游，acactccagctggggagttcactc; 下游ctca actggtgtcgtgga. CDKL2 3#39;-UTR PCR 扩增引物: 上游，ccgctcgagTGAAGAAACTAGGATCAGTAAGAGAAA; 下游ataagaatgcggccgcTCTAGTATCACCCTTAAACTACCAGGG. 分别以HSV-2 333 病毒株和Vero 细胞的DNA 为模板分别扩增出miR-H4-5p 前体和CDKL2 3#39;UTR 序列. miRH4-5p 前体扩增条件是: 98℃ 预变性3 min，98℃30 s，49℃ 40 s，72℃ 30 s，34 个循环，72℃ 后延伸10 min. CDKL2 3#3