分析辣椒素对P-糖蛋白和细胞旁途经转运透过的作用.docVIP

分析辣椒素对P-糖蛋白和细胞旁途经转运透过的作用 　　P-糖蛋白(P-gp)是限制药物从血液循环进入脑和从肠腔进入上皮细胞的重要转运蛋白[1]，故联合使用P-gp抑制剂可以增加药物经肠道吸收。Hamilton等首次发现维拉帕米、环孢菌素A(CsA)能与化疗药物竞争性结合P-gp，逆转大肠癌耐药性(MDR)，但其心肾毒性及免疫抑制作用明显，限制了临床应用。近年来，一些植物化学和本草纲目中的药物，也发现具有抑制P-gp功能的作用，如本派丙烷和姜黄，与合成的抑制剂相比它们具有更低的毒性。我们经常食用的辣椒中所含的主要成分辣椒素(CAP)也表现出对P-gp功能的抑制作用。体外结肠癌Caco-2细胞实验发现，辣椒素能够抑制P-gp对地高辛的外排作用。由于众多实验结果均是采用细胞研究获得，由于细胞的一些形态学和生理学的局限性，并且P-gp在肠道中的分布是不均匀的，因此采用细胞无法预测药物对不同肠区段粘膜上P-gp的影响，所以我们采用Ussing chamber法分别研究了辣椒素对空肠、回肠和结肠粘膜上P-gp功能的影响，并用荧光素钠(CF)作为细胞旁途径药物转运方式的标志物进行检测。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试剂 辣椒素(批号：048K5058V)，Hepes(批号：016K54331)，Trizma base(批号：103K5411)，罗丹明123(批号：046K3688)、荧光素钠(批号：047K0676)均购于Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA)。甲醇和乙腈为HPLC级别，购买自德国莫克公司。 　　1.1.2 仪器 荧光分光光度仪(美国Waters公司，型号为474);P13110S 电子天平，德国 Sartorins 生产;7 mlUssing chamber装置(美国Harvard公司)。1.1.3 动物 SD大鼠，雄性，体质量250plusmn;20 g，购于南方医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK 粤 2006-0015。动物实验的方法符合南方医科大学实验动物伦理委员会的有关规定和要求。 　　1.2 方法 　　1.2.1 药物溶液配制 　　1.2.1.1 Hepes-Tris 缓冲液的配制 取 Hepes 6 g 溶于800 ml蒸馏水中，使之完全溶解。通入混合气体(95% O2，5% CO2)10 min后，加入1.8 ml KCl(3 mol·L-1)、1.8 mlCaCl2(1 mol·L- 1)、0.8 ml MgSO4(1 mol·L- 1)、8.18 gNaCl，完全溶解后用TrisRONGYE(1 mol· L-1)调节pH至7.4，再加入5 ml葡萄糖溶液(1 mol·L-1)，用蒸馏水稀释至1000ml，混匀即得。 　　1.2.1.2 实验溶液配制 分别将辣椒素与R123或CF溶解在pH 7.4的O2/CO2气体饱和的Hepes-Tris缓冲液中，这种Hepes-Tris溶液每天制备，实验用辣椒素质量浓度为60mg·L-1，R123或CF最终质量浓度均为4mg·L-1。 　　1.2.2 体外Ussing chamber实验 SD大鼠禁食16~18 h，3%戊巴比妥钠(12 ml· kg-1)腹腔注射麻醉，延腹中线将腹部切开，取出空肠、回肠和结肠。分别用生理盐水清洗干净，置入冰浴的Hepes-Tris缓冲液中通混合气(95% O2∶5% CO2)培养。剪取空肠适量，于冰浴板上迅速剥离浆膜侧的浆膜层，将肠粘膜固定于扩散池上，回肠及结肠的操作方法与空肠相同。在扩散室加入7 mlR123或CF与CAP的混合液，接收室加入7 ml Hepes-Tris缓冲液(均预热至37.5 ℃);37.5 ℃保温，并通入混合气体。分别于15、30、45、60、75、90和120 min在接收室取样0.5 ml，并同时补充相同体积相同温度的Hepes-Tris缓冲液。 　　1.2.3 定量方法的建立 　　1.2.3.1 R123和CF的测定方法学考察 R123的激发波长为485 nm，发射波长为535 nm，可在此波长下测定R123 的荧光强度，空白无干扰，其荧光图谱如图 1。R123 在(15.625~500)micro;g· L- 1，荧光强度对浓度进行回归，标准曲线回归方程为：Y=1.0435X-1.0989，R2=0.9982，Y为吸光度，X为浓度。回收率和日内精密度分别为98.9%和1.9%。CF的激发波长为480 nm，发射波长为520 nm，可在此波长下测定CF的荧光强度，空白无干扰，其荧光图谱如图2。CF在(7.8125~500)micro;g·L-1，荧光强