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ELISA方法检测鸡蛋中的抗生素 赵兰青，邓明镜，高阳 （北京科技大学，化学与生物工程学院，生技0901班，100083）[摘要] 建立了以间接竞争酶联免疫吸附分析法为基础，经过包被抗原，加氯霉素标准品溶液和待测样品溶液后，再加抗体，然后加酶标记二抗和反应底物，最后加终止液后测量490nm下吸光度值等操作步骤后，测定了氯霉素浓度的检测下限为5ng/mL，定量范围为：5-50ng/mL。氯霉素浓度的对数值Log10（vtg）与结合率B/B0(%)的标准曲线方程为：y = -45.952x + 115.48，R2 = 0.9943，根据0-50 ng/mL相对应的曲线计算了未知样的浓度vtgS1=1.199ng/mL，vtgS2=386.1ng/mL，但是与实际浓度相差较大，且回收率异常。最后对实验结果和干扰因素进行了分析，以及对失败原因的探索，并进一步研究了实验条件的优化。[关键词] 间接竞争ELISA方法 氯霉素 分光光度法 引言 ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由瑞典的EngVall 和荷兰Van Weeman等人提出，1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELISA操作更方便、易重复，灵敏度可高达ng至pg，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一；原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。因为其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。ELISA常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白（二抗），使与特异抗原抗体复合物的抗体作用，加入酶底物，显色。ELISA有许多改良方法，如夹心法、双抗夹心法、竞争法、酶—抗酶法和均质法等。常用方法大致可分为三类：（a）测定抗体的间接法；（b）测定抗原的双抗夹心法；（c）测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。本实验旨在建立一种简单、快速、回收率高的氯霉素含量测定方法，改良优化其方法步骤，以节约实验室检测的费用及检测的时间，并进一步应用于食品安全检测。实验部分试剂与器材 2.1.1 试剂 抗体：鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体 抗原：CAP-BSA 酶标记抗体（二抗）：HRP-羊抗鼠 样品：鸡蛋 缓冲液： 1）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159克，NaHCO3 0.294克，蒸馏水稀释至100mL）。2）洗涤及稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBST溶液。（NaCl 8克，KH2PO4 0.2克，Na2HPO42.9克，Tween—20,0.5mL.蒸馏水加至1000mL）。3）底物溶液：先配制pH5.0柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液。取0.1mol/L柠檬酸溶液24.3mL，加0.2mol/L(27.4g/L)NaHPO4溶液25.7mL，再加蒸馏水50mL，然后将80mg邻苯二胺溶解其中，再加30%H2O2 0.20mL即可应用，用时新鲜配制、避光。4）终止液：2mol/LH2SO4。 2.1.2 器材聚苯乙烯微量反应板（96孔），可调式微量吸液器（200uL），八道可调式移液器，培养皿，小烧杯，隔水式恒温箱，酶联免疫检测仪实验步骤2.2.1 包被抗原用包被液将抗原稀释为2ug/mL，每孔加150uL，4℃冰箱放置16~18小时。2.2.2 洗涤倒尽板孔中液体，加200uL洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。2.2.3 封闭用稀释液将BSA稀释成浓度为200ug/mL溶液，每孔加150uL，37℃放置1小时。2.2.4 洗涤 倒尽板孔中液体，加200uL洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。2.2.5 加标准品 用稀释液将氯霉素标准品稀释成0.2ng/mL至100ng/mL溶液，每孔50微升。同时作稀释液对照。（因为4.7中加入50uL抗体，所以氯霉素被稀释为原浓度的1/2，即0.1ng/mL至50ng/mL）2.2.6 加被测液如下图所示，加入被测样，每孔50微升。表1 酶标板上各孔的加样设计123456789101112ABLKBLKBLKBLKBLKBBLK00S1BLKCBLK0.10.1S1BLKDBLK0.50.5S1BLKEBLK11S2BLKFBLK55S2BLKGBLK1010S2BLKHBLK5050BLKBLK （