从HPLC到UPLC的方法转换以适应更高的分析通量.docVIP

从HPLC到UPLC的方法转换以适应更高的分析通量 一个典型的HPLC分析方法成功地转换并优化为Waters ACQUITY UPLCTM方法，既达到了样品分析的高通量又得到更高的分析灵敏度。提出了进一步快速转换方法的策略。对运行成本和样品通量的分析表明：UPLC的成本优势要超过HPLC。  日益增长的制药行业大批量样品分析的需求，促进了ACQUITY Ultra Performance LC (UPLCTM)的研制和开发。这个系统之所以能够提供如此快速的分析，得益于它采用了小颗粒杂化填料(1.7μm)，它具有极好的分离度和奇特的化学特性。(1-5) 为了与这种小颗粒杂化填料相匹配，实现快速分析，Waters公司在普通液相色谱的基础上，从色谱柱到色谱系统都进行了大幅度改进。要实现真正的超高效液相色谱分离，UPLC仪器系统必须耐高压（高达15000psi）、死体积小，且检测器的数据采集速率要大大提高以与高速流出的色谱峰匹配。新型的针内针设计真正地防止了交叉污染，极大地提高了检测灵敏度。 在本文中，一个用于质量控制（QC）的HPLC方法被优化为UPLC方法，目的是减少总运行时间，降低分析成本和增加仪器正常运行时间。 方法的开发 初始的HPLC方法为：分析时间：10分钟，样品：溶于有机溶液中的杂环药物（Cpd A）。加入内标以补偿样品前处理所造成的损失，采用梯度是必要的，目的是清洗后面流出的干扰物。 从普通HPLC方法转换为UPLC方法，开始仅仅是将流动相流速、进样体积进行简单的换算。换算因子由色谱柱横截面积的比率得到，以保持相同的线速度。 从UPLC得到的色谱峰是非常窄的，超凡的分离度表明方法尚有改进的余地。原来认为：只要柱反压允许，流动相的流速可以随意提高。但是后来对色谱柱寿命的研究表明，用提高流动相中的有机相含量的方法来缩短分析时间似乎更经济合算，溶剂的消耗也大大减少。 图（1）显示的是由最初HPLC方法通过简单的按比例缩小得到的UPLC色谱图。最下面的是经过优化的UPLC色谱图。表?Ⅰ列出了HPLC及UPLC方法具体的色谱条件及药物分析结果 。 方法优化指南及探讨 在优化UPLC方法时除要考虑方法转换的速度外，还应考虑以下几点： 利用UPLC高分离度的优势，增加流动相的强度，可以缩短分析时间。（见表Ⅱ） 对延长色谱柱寿命来说提高流动相的流速不如增加溶剂强度。虽然，UPLC可以做到在高流动相线速度下仍保持良好的分离度。然而，对于任何柱子，经常在80%最大流速压力下运行都会减少色谱柱的寿命。（见图2）。依据我们的经验，与HPLC相比，UPLC在反压达到8000psi时柱损耗还是比较低的。尽管与传统的HPLC相比，UPLC的损耗已经很小（比HPLC降低了一个数量级），但是若尽可能地保持低流速，还可以进一步减少溶剂的损耗和废液的处理费用。  由于UPLC的系统体积很小，可以减少色谱柱的再平衡时间。流动相的变化需要一定的时间才能到达色谱柱。UPLC极低的系统体积（110μL，仅为HPLC的15%)允许进一步缩短分析时间。在UPLC上，当下一个样品进样时，色谱柱已达到了再平衡。它使得分析通量进一步提高。 根据色谱柱的内径，适当地减小进样体积，可以得到更好的峰形。当过量的强溶样溶剂加到色谱柱头时，色谱峰会分叉。UPLC一般最大允许进样体积为5μL，依据我们的经验，一般采用1-3μL。值得一提的是：由于UPLC色谱柱的分离度高、进样器的交叉污染很低，这么小的进样量也会得到理想的峰高、达到相当或更低的LOQ（测试结果表明：UPLC的交叉污染仅为HPLC的10%）。另外，小体积进样还可以降低样品溶剂的强度，使得样品在柱头集中进样。 尽量先试用部分定量环进样方式，如图（3）所示：即使当进样体积达到定量环的80%时，部分定量环进样都能得到很好的精密度。在传统的HPLC检测中，一般进样量的体积都是控制在定量环体积的50%左右。UPLC的进样系统用两段气隙将样品夹在中间，能更好地利用定量环且精密度更好。这种进样方式比满定量环进样方式更节省样品。从实验的角度来看,满定量环进样需要足够多的样品才能实现充满定量环的功能。这样可能要增加随后的洗针，将会影响样品通量和加大洗针硬件的磨损。大体积的样品转换也增加了样品颗粒析出的可能性，影响仪器的长期可靠性。  如果想采用满定量环进样方式(也许是为了满足非常高的精密度的要求)，则要保证样品在定量环内充分溢出。在很窄的UPLC进样管线内，样品在管壁边的流速和在管中心的流速是不同的。采用满定量环进样，至少要用四倍定量环体积的样品溢流定量环，以确保样品将洗针液从5μL定量环中置换掉。UPLC仪器在出厂时对每一种规格的定量环