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河南大学医学院实验课教案首页 实验名称 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 授课对象 教学目标 学时分配 大体内容与时间安排：(8学时) 掌握血清蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 讲授时间60分钟 理解电泳过程中的三种效应 讲授时间30分钟 讲授时间90分钟 学生操作时间310分钟 授课重点 1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 2.制胶、加样、电泳、染色、脱色等基本操作。 授课方法 课前准备 讲授为主，结合提问、总结，指导纠正 教材 《生物化学 主编 人民卫生出版社凝胶制备、加样、电泳mm ）, 用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60 min。当凝胶完全聚合时，可看到清晰的胶水界面。 (2)浓缩胶的制备 用滤纸吸去分离胶上层多余的水，但不要碰破胶面。再用注射器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次，即可制备浓缩胶。取凝胶贮备液lml，浓缩胶缓冲液1．25ml、蒸馏水7．5ml、100g／L SDS 0．1ml、TEMED(或DMAPN)0．05ml、100g／L过硫酸铵0．1ml，混匀，立即用细长头滴管将凝胶溶液加到分离胶的上方，约1cm厚，上面同样加一层水，静置40min，使其充分聚合。凝胶聚合后，用去离子水冲洗以除去未聚合的丙烯酰胺。用滤纸吸去浓缩层多余的水。准备加样。 2．样品预处理和加样 在作考马斯亮蓝染色时，取血清0．1ml、上样缓冲液0．9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。用微量注射器依次将样品加到各柱孔内，上样量一般20～40μl。作银染色时，取血清0．05ml，上样缓冲液4．95ml，混合，其他操作同上。注意加已知分子量的标志蛋白质。然后在样品上小心加入电极缓冲液至满管，切勿搅动样品。 3．电泳 将已加好样的凝胶柱，去除下端的橡皮塞或胶带，垂直插入到电泳槽中。在上下槽中加入电极缓冲液，上槽的液面要超过玻璃柱上端4～6cm，下槽缓冲液要全部浸没凝胶柱下端，端末不能有气泡。盖好电泳槽盖，上槽接负极，下槽接正极。接通电源，开始电泳，电流控制在2～5毫安／管。约2小时左右，当指示染料抵达距分离胶下端约1cm处，断开电源，停止电泳。 4.凝胶分离 电泳结束后，取出凝胶柱，用带长针头的注射器，小心地沿着凝胶与玻璃柱壁之间慢慢注入水并转动一周，凝胶就能脱离滑出，或用洗耳球在玻璃柱的一端稍加压力，凝胶自然地压出。在凝胶柱的一端插一东西作为标记，将凝胶移至大培养皿中。精确量取并纪录凝胶长度（分离胶）和指示染料的迁移距离（分离胶上缘到染料条带中心距离。） 5．氨基黑染色 将凝胶放入氨基黑染色液中，染1小时左右。然后取出凝胶放在5%冰醋酸溶液中漂洗，并多次更换漂洗液，至背景无色为止。其它如取出凝胶、量取凝胶长度和指示染料迁移距离的操作同考马斯亮蓝染色法。 注意事项 制胶过程中用蒸馏水封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大，否则会出现过载现象。尤其是考马斯亮蓝R250染色，在蛋白质浓度过高时，染料与蛋白质的氨基（-NH3+）形成的静电键不稳定，其结合不符合beer定律，使蛋白质定量不准确。 Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。 思考题 1.该实验是如何去除蛋白间电荷效应的？ 2.使SDS具有高分辨率的三个因素是什么？ 实验后记 此试验效果较好，结果易观察，但时间较长。