蛋白的检测的方法.docVIP

使用Lumio?技术快速检测体外表达的蛋白质 简介众所周知，蛋白质体外合成系统是一种快速、有效地表达蛋白质的方式。然而，通常体外基因的表达会产生一些阻遏问题。相比之下，Invitrogen的Expressway?Plus表达系统提供了一种直接、简便的方法用于获得高产量的功能性活性蛋白质。现在，我们推出一种改进的Expressway? Plus系统，即使用Lumio?技术来快速检测蛋白质产物。Lumio?技术是基于FLAsH( Fluorescein Arsenical Hairpin)技术，是一种联胂的荧光素衍生物和四半胱氨酸序列的耦合物（图1）。该四半胱氨酸序列由“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys””组成，其中的Xaa指非半胱氨酸的氨基酸。我们通常选择的Xaa-Xaa是Pro-Gly，因为有报道指出pico-molar的离解常数与FLAsH一致。 图1 Lumio?试剂与四半胱氨酸序列结合的示意图 Lumio?试剂处于非结合状态时基本上无荧光性。然而，通过与四半胱氨酸序列结合，Lumio?试剂变得具有高度的荧光性。当Lumio?试剂与四半胱氨酸标记的肽或蛋白质结合，在505nm处有吸收峰，并且，在528nm处有最大的绿色荧光发射。 配合使用改进的Expressway? Plus系统，Lumio?技术可用于快速、简便的检测体外表达的蛋白质产物。该试剂盒的关键组成部分是pEXP3-DEST载体、Lumio?绿色检测试剂和一种改进的无细胞的提取物（来源于一种大肠杆菌slyD突变株）。这种多用途的Lumio?技术可以监测Expressway? Plus体外合成反应中生成蛋白质的协同翻译过程。Lumio?试剂的独特性就在于其能够进行显著的转换，即通过与四半胱氨酸序列结合，完全没有荧光的状态转变成一种具有高度荧光的状态。您可以利用这种新的特性，对不断生成的蛋白质进行实时快速的地观察、分析。若采用一个标准的荧光板reader，监测体外反应的混合物中Lumio?序列实时快速地整合到新合成的蛋白质中。由于Lumio?的绿色检测试剂具有结合位点专一性的特点，所以能够对蛋白质表达水平定量分析。此外，Lumio?绿色检测试剂可以在电泳以前直接添加到蛋白质样品中。电泳以后，利用标准的紫外检测仪或激光凝胶扫描仪，就可以立即显示出蛋白质产物，而无须使用放射性物质。Lumio?试剂非常牢固地共价结合到四半胱氨酸序列上，这就减少了许多处理蛋白质凝胶的步骤，诸如固定、染色、脱色、干燥等操作。另外，与使用放射标记氨基酸相比，所有安全性、处理一次性废品等常规项目都可以省去。Lumio?技术在检测和分析蛋白质体外合成产物方面具有极大的优势，并且彻底变革了评价无细胞系统中蛋白质表达的方法。 材料和方法pEXP3-DEST表达载体的构建我们使用pEXP1质粒构建了具有N-末端及TEV蛋白酶剪切位点的pEXP3-DEST载体。通过将入门载体、目标载体和LR ClonaseTM酶混合，UltimateTM人ORF激酶入门载体，CAT、GFP和GUS与pEXP3-DEST载体进行重组。孵育一小时后，该混合物转化到常TOP10 E.coli化学感受态细胞中，然后涂板、挑取克隆，用于载体扩增和分离DNA。蛋白质合成标准的Expressway?附加蛋白质合成反应的方法：将4μl无DNA酶/无RNA酶的水，20μl 2.5X的IVPS Plus大肠杆菌反应缓冲液，1μl T7 RNA聚合酶，以及20μl IVPS Plus大肠杆菌提取物置于2ml试管中预先混合，冰浴；添加1mg DNA模板，用水定容至反应的终体积50μl，然后充分混合。在37℃温育两小时进行反应或在96孔板上并置于荧光仪中。在体内产生腺苷酸激酶1。在凝胶中检测凝胶样品的制备方法：将50μl反应物中的5μl样品在20μl 100%的丙酮中4℃孵育超过20分钟，析出沉淀。然后将反应物置于微型离心机内以最大速度离心5分钟。将丙酮吸出，然后将沉淀颗粒重新悬于50μl 一倍的Lumio?绿色检测试剂中。将1ul该物进样到4-12% NuPAGE?梯度凝胶中。使用紫外检测仪或Typhoon 8600可调式成像仪对凝胶进行检测。为得到所有蛋白质的条带，可先将凝胶用考马斯亮蓝染色。实时监测蛋白质表达将50μl体外蛋白质合成的反应物与20μM Lumio?绿色检测试剂在96孔板中37℃孵育，直接通过分子光谱仪Max GeminiXS 读板仪实时检测Lumio?序列的整合。将激发光波长设定在500nm，同时发射光设定在535nm。在两小时的孵育时间内，每十分钟收集一次读数。对GFP产物的实时监测可以通过类似的方式进行，只不过不需要添加Lumio?绿色荧光检测试剂。结果与讨