蛋白纯化方法(从Cell文章中学到的高效蛋白纯化方法).docVIP

各位好，以下是为大家总结的蛋白纯化方法使用说明 目 录 一、 2 二、 2 三、 3 四、 3 五、 4 六、 4 七、 5 八、 6 九、 10 说明书中的应用实例都发表在国际学术权威期刊上，如Cell等，望大家学习！如需这些高水平文章原文，请发邮件至service1@，我将为您提供原文。 SSB亲和层析使用说明书 简介 噬菌体T7 单链DNA结合蛋白（SSB, single-stranded DNA binding protein）由696bp核苷酸编码，计算分子量为 25.6kDa（SDS凝胶电泳，该蛋白条带约在27 kDa位置）。它与单链DNA有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一特性，将SSB构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有SSB标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链DNA高效、特异性结合，这种结合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变洗脱液的pH值或盐浓度对融合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。 pSSB系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融合蛋白的N端或C端带有SSB标签。SSB标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切除，pSSB系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase）、凝血酶、TEV等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要决定是否切除标签。 SSB亲和层析介质（经过特殊处理的ssDNA-cellulose）是专门设计用于纯化SSB融合蛋白及与目的蛋白有亲和作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯度洗脱可得到高纯度的SSB融合蛋白。纯化条件温和，不引入其他物质，能够保证蛋白的活性。 pSSB载体 现有的pSSB载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类; 2）酵母类; 3）人细胞类；4）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有N端和C端的SSB标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将SSB标签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各自的启动子实现严格调控插入片段的表达。相关参数如下页表一所示： 表一：pSSB系列载体 宿主 载体 SSB位于目的蛋白的N端或C端 抗性 启动子 蛋白酶切位点 是否带His标签 大肠杆菌E.coli pSSB-E1 N端 卡纳抗性 T7 肠激酶 否 pSSB-E2 N端 卡纳抗性 T7 肠激酶 是 pSSB-E3 N端（SSB(△26C)标签） 卡纳抗性 T7 肠激酶 是 pSSB-E4 N端 卡纳抗性 T7 凝血酶 是 pSSB-E5 N端 卡纳抗性 T7 凝血酶 否 pSSB-E6 C端 卡纳抗性 T7 肠激酶 是 酵母Yeast pSSB-Y1 N端 卡纳抗性 nmt1 肠激酶 是 pSSB-Y2 N端 氨苄抗性 nmt1 肠激酶 是 pSSB-Y3 C端 氨苄抗性 nmt1 肠激酶 是 人细胞Human pSSB-H1 N端 氨苄抗性 CMV TEV 是 pSSB-H2 C端 氨苄抗性 CMV 肠激酶 是 昆虫细胞 Insect pSSB-I1 N端 氨苄抗性 PH 肠激酶 是 pSSB-I2 C端 氨苄抗性 PH 肠激酶 是 具体信息详见网站：。 插入基因片段 每一个pSSB表达载体设计有多个克隆位点。 根据需要，DNA片段可被插入到某一特定的位点。 优化表达 插入DNA片段的方向和载体的连接确定无误后，下一步将要优化带SSB标签融合蛋白的表达，确定了最佳的蛋白表达水平及相应的生长条件后就可以进行大规模的培养。 生长条件应考虑最佳的蛋白表达水平，确定一系列诸如培养基、生长温度、密度、诱导条件等参数。保证足够的通气条件、缩短各个生长时期的时间以及使用正确的抗生素进行筛选都是非常重要的。同时应当确定表达的融合蛋白是在包涵体状态或可溶状态。SSB在一定程度上可以促进目的蛋白的溶解，但有时候会因为过度表达而导致蛋白不能以正确的方式折叠，从而形成包涵体。为降低包涵体的形成，可以适当调整培养基条件来提高重组蛋白的溶解能力，如：生长温度降低至15-30℃，增加通气，改变诱导条件如降低蛋白表达的速率等。 ssDNA-cellulose ssDNA-cellulose由单链DNA（ssDNA）与处理过的cellulose进行偶联所得，大约1g cellulose可以偶联2-3mg 的ssDNA。ssDNA可以与SSB特异性结合，且1ml 溶胀好的ssDNA-cellulose柱料可以结合1-2mg 的带有SSB 标签的融合蛋白。此介质是自主设计合