DNA提取讲义.docVIP

(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入1.5mL离心管中； (2)每管加入600μL SDS DNA提取液（含2%的巯基乙醇），于65℃水浴30min，其间温和混匀几次； (3)取出离心管，加入60μL 5mol/L KAc，立即上下颠倒温柔混匀（5~6次），冰上放置20min； (4)于12,000 rpm离心10min； (5)将上清液（约600μL）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温放置5min； (6)加入600μL酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）； (7)于12,000 rpm离心15min； (8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7倍体积的异丙醇，于-20℃下沉淀10~30min； (9)于10,000 rpm离心5min，弃上清，将沉淀用75%乙醇洗2~3次； (10)挥发干净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存; (11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 实验目的CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 植物总基因组DNA提取纯化方法综述(转)默认分类 2010-07-27 09:08:38 阅读179 评论1?? 字号：大中小 订阅??????? DNA 提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前植物分子的DNA 提取,已经发展了多种方法,成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下,不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取基因组植物分子DNA 时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理 。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、单宁等物质与DNA 会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA 常出现产量低、质量差、易降解,影响了 DNA 质量和纯度,不能被限制性内切酶酶切,严重的甚至不能作为模板进行PCR 扩增。针对这一现象,已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的基因组DNA 提取纯化进行了改良和发展。笔者就植物DNA 提取各个环节,如样本的采集与保存、提取缓冲液成分的作用、DNA 提取纯化方法等进行归纳,同时对DNA 提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。 1 　植物样品的采集与保存 ??????? 植物组织材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料,采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分,在取样时立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料,放置在密闭的冰盒中,这样可使组织材料3～5 d 仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时,在可能的条件下冷冻保存(如放置于液氮中) ;当不具备冷冻条件时, 最好用盛有无水CaSO4 的瓶子分别保存, 使其迅速干燥, 这种方法可将材料保存数月,返回后应尽快进行DNA 的提取工作。对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料, 应尽可能采集幼嫩组织外, 最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA 提取。植物组织材料的化学保存法,如乙醇、丙二醇处理法,通常会导致DNA 剧烈降解, 因此,不作为推荐的保存方法 。对于采集回来的样品如要长期保存,应经液氮处理后贮存在- 80 冰箱或直接储放于液氮中,且在与提取缓冲液接触前,应防止冰冻的样品在空气中融化,否则酚类易被氧化。 2 　提取缓冲液??????? 随着现代分子生物学的发展, DNA 分离技术也层出不穷, DNA 已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获得DNA。无论是什么材料, 针对不同的来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及不同的技术方案是十分重要的。在实际应用中可针对不同的情况对具体实验方案的各个部分进行不同组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化,缓冲液的pH值、保护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化。十二烷基磺酸钠(SDS) 是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用; 而十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂。乙二胺四乙酸(EDTA) 可用于抑制金属离子依赖性的酶